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蛋白質組研究酶解常見問題

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-01

1. 用 Trypsin 酶解蛋白質時,碳酸氫氨的濃度應該是多少?
酶解時碳酸氫氨的濃度一般在 10 ~ 50 mM 之間。碳酸氫氨的作用主要是提供一個堿性的水解環境,因為 Typsin 的活力在 pH8 ~ 9 之間最高。最常用的碳酸氫氨濃度有 20 mM , 40 mM 。鹽濃度過大時,后續的凍干過程中會有較多的鹽析出;鹽濃度過小時,則不能有效的提供堿性 pH 的水解環境(尤其是在樣品的 pH 值低,而且體積大時)。為了確定酶解體系的 pH 值,可以用

2. Trypsin 儲存液的作用是什么?
Trypsin 在 pH8 ~ 9 活力最高,所以為了防止酶的自水解, Trypsin 母液要處于一個酸性的環境里以便長期保存。 Trypsin 儲存液的 pH 大約是 5.3 ,是用來稀釋母液用的。如果所需的酶量較大,可以直接用碳酸氫氨溶液來稀釋母液。如果酶解的樣品少,可以用儲存液來稀釋,這樣剩余的酶液可以在 -800C 保存到下次使用。

3. Roche 的酶和 Promega 的酶,那個更好?
Roche 的酶有自降解,而 Promega 的酶基本上沒有自降解。由于酶的自降解峰可以用來做很好的內標,所以一定限度的酶自降解對 MALDI 數據的校準很有幫助。

4. 什么情況下需要用 Ziptip 來處理樣品?
當樣品含有大量的鹽時,需要用 Ziptip 來除鹽;當樣品量很少,但體積比較大時( 20 微升以上)時,需要用 Ziptip 來濃縮。如果樣品中有甘油, SDS ,或其他雜質時, Ziptip 的使用要格外當心,在這種情況下, Ziptip 的填料容易被雜質堵塞;另外 Ziptip 使用不當時,樣品會有損失。所以當樣品比較珍貴(的來不易)時,最好先用其他樣品做預實驗,摸順條件后,再作真正的樣品。

 
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