斑點雜交(Dot blot)是將被檢標(biāo)本點到膜上,烘烤固定。這種方法耗時短,可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品,為使點樣準(zhǔn)確方便,市售有多種多管吸印儀(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它們有許多孔,樣品加到孔中,在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔,取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本,這時的膜就可以進(jìn)行雜交。
(1)DNA斑點雜交:
①先將膜在水中浸濕,再放到15×SSC中。
②將DNA樣品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。
③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。
④將膜烘干,密封保存?zhèn)溆谩?
(2)RNA斑點雜交:與上法類似,每個樣品至多加10μg總RNA(經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化),方法是將RNA溶于5μl
DEPC水,加5μl甲醛/SSC緩沖液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA變性,然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上,烘干。
(3)完整細(xì)胞斑點雜交:應(yīng)用類似檢測細(xì)菌菌落的方法,可以對細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測,將整個細(xì)胞點到膜上,經(jīng)NaOH處理,使DNA暴露、變性和固定,再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本,因為它使細(xì)胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法還高,又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交,但它不適用于非放射性標(biāo)記探針,因為DNA純度不夠,會產(chǎn)生高本底。
(1)DNA斑點雜交:
①先將膜在水中浸濕,再放到15×SSC中。
②將DNA樣品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。
③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。
④將膜烘干,密封保存?zhèn)溆谩?
(2)RNA斑點雜交:與上法類似,每個樣品至多加10μg總RNA(經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化),方法是將RNA溶于5μl
DEPC水,加5μl甲醛/SSC緩沖液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA變性,然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上,烘干。
(3)完整細(xì)胞斑點雜交:應(yīng)用類似檢測細(xì)菌菌落的方法,可以對細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測,將整個細(xì)胞點到膜上,經(jīng)NaOH處理,使DNA暴露、變性和固定,再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本,因為它使細(xì)胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法還高,又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交,但它不適用于非放射性標(biāo)記探針,因為DNA純度不夠,會產(chǎn)生高本底。