如何設計有效的siRNA一直是當前RNAi研究的熱點話題.基因抑制的有效性很大程度取決于目的基因序列的選擇。目的序列可以隨機選擇也可以通過在目的基因的不同區域上測試不同的序列以決定何種序列是最有效的。以下所述幾條對于siRNA設計的成功極為重要。

1. 從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。正義鏈和反義鏈都采用這19個堿基(不包括AA重復)來設計。

2.避免在起始密碼子或無義區域附近選擇目的序列。

3.SiRNA序列的GC含量應為30%-50%左右。

4. Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

5. 將挑選的序列在公共數據庫中進行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源性。

6.將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST

7.選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

8.負對照:一個完整的siRNA實驗應該有負對照，作為負對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和其他基因沒有同源性。

如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3'dTdT結尾，如果要UU結尾的話通常要特別說明。有結果顯示，UU結尾和dTdT結尾的siRNA在效果上沒有區別。因為這個突出端無需和靶序列互補。