目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括:
1.化學(xué)合成
2.體外轉(zhuǎn)錄
3.長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解
4.siRNA表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs
5.PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)
前三種方法經(jīng)過體外制備siRNAs然后應(yīng)用專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；后兩種方法則這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA，依賴能夠表達(dá)siRNAs的DNA載體或者基于PCR的表達(dá)框架轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模板在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。哪種是最好的方法，其實(shí)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />
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比較項(xiàng)目 |
體外制備siRNA |
體內(nèi)表達(dá)siRNA |
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化學(xué)合成 |
體外轉(zhuǎn)錄 |
RNase III降解dsRNA |
SiRNA 表達(dá)載體 |
PCR 表達(dá)框 |
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設(shè)計(jì)和篩選最有效siRNA序列 |
需要 |
不需要 |
需要 |
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材料需求 |
21ntsiRNA |
29nt siDNA |
轉(zhuǎn)錄模版 (200-1000bp) |
45-50nt dsDNA |
~50nt dsDNA |
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制備規(guī)模 |
大量 |
受限 |
大量 |
受限 |
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合成/制備 轉(zhuǎn)染 所需時(shí)間 |
4天-2周 |
dsDNA合成時(shí)間 1天 |
轉(zhuǎn)錄模版制備時(shí)間 1天 |
dsDNA合成時(shí)間 5天以上 |
dsDNA合成時(shí)間 6小時(shí) |
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個(gè)人所需操作時(shí)間 |
幾乎沒有 （只需定購） |
中等 |
長 |
中等 |
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標(biāo)記siRNA 進(jìn)行細(xì)胞定位 |
能 |
不能 |
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轉(zhuǎn)染的難易程度 |
專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑或者電轉(zhuǎn)染 |
DNA轉(zhuǎn)染，不直接操作RNA |
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檢測總體轉(zhuǎn)染效率 |
不能 |
能 |
不能 |
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抑制時(shí)效（即穩(wěn)定性） |
短暫 |
長期 |
短暫 |
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制備費(fèi)用 |
高 |
相對較低 |
低 |
中等 |
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