1. 對每個基因設(shè)計(jì)并檢測兩到四個siRNA序列
為了找到潛在靶位點(diǎn)，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3’端19個核苷酸作為潛在siRNA靶位點(diǎn)。潛在靶位點(diǎn)需通過GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點(diǎn)。如果可能，siRNA應(yīng)根據(jù)mRNA低二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計(jì)。美國著名RNA產(chǎn)品公司Ambion提供網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具，幫助您更快地完成這項(xiàng)工作。網(wǎng)址為：www.ambion.com/techlib/misc/
siRNA_finder.html
2. 選擇低GC含量的siRNA
Ambion公司研究發(fā)現(xiàn)GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。
3. 純化體外轉(zhuǎn)錄siRNA
在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫（Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度）或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
4. 避免RNA酶污染
微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實(shí)驗(yàn)每個步驟不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產(chǎn)品線，如除RNA酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測和去除RNA酶。
5. 健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性
通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。
6. 避免適用抗生素
Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用抗生素�？股貢诖┩傅募�(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。QIAGEN推出的專門針對RNA轉(zhuǎn)染的試劑
7. 選擇好的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA
針對靶細(xì)胞類型，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。siRNA實(shí)驗(yàn)要求選擇適合轉(zhuǎn)小的RNA的轉(zhuǎn)染試劑（目前大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑都針對轉(zhuǎn)染比較大的質(zhì)粒DNA，而非小的RNA分子，宿主范圍大小也不同）。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專門針對轉(zhuǎn)siRNA優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑，是您的理想選擇。
8. 通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件
對大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計(jì)對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA。
9. 通過陰性對照siRNA排除非特異性影響
合適的陰性對照可通過打亂活性siRNA的核苷酸順序設(shè)計(jì)而得。必須注意它要進(jìn)行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。
10. 通過標(biāo)記siRNA來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
熒光標(biāo)記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來。
