用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類 型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。
　　用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實驗中，為產(chǎn)生對反向 PCR大小適當?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切 酶失活。
　　聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環(huán)。可改變PCR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測序時，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部 分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。