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質粒載體的粘端DNA連接

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-02

(1)用適當的限制酶消化質粒和外源DNA。如有必要,可用凝膠電泳分離片段并(或)用堿性磷酸酶處理質粒DNA。通過酚:氯仿抽提和乙沉淀來純化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
(2)按如下所述設立連接反應混合物:
a.將0.1μl載體DNA轉移到無菌微量離心管中,加等摩爾量的外源DNA。
b.加水至7.5μl,于45℃加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈,將混合物冷卻到0℃。
c.加入:10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液 1μl
T4噬菌體NDA連接酶 0.1Weiss單位
5mmol/L ATP 1μl
于16℃溫育1-4小時
10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白(組分V.Sigma產品)(可用可不用)
該緩訓液應分裝成小份,貯存于-20℃。
另外,再設立兩個對照反應,其中含有(1)只有質粒載體;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每個連接反應可用50-100ng質粒DNA,并盡可能多加外源DNA,同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數制造廠商(除New England Biolabs公司外)現在都用Weiss等,11968)對該酶進行標化。1個Weiss單位是指在37℃下20分釧內催化1mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時,1個Weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位(Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位(如New England Biolabs公司所定義)。因此,0.015Weiss單位的T4噬菌體DNA連接酶在16℃下30分鐘內可使50%的λ噬菌體HindⅢ片段(5μg)得以連接。在本書中,T4噬菌體DNA連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液(1-5單位/μl),可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的T4噬體DNA連接酶于-20℃保存3個月可保持穩定。
(3)每個樣品各。保μl轉化大腸桿菌感受態細胞。

 
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