（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混勻，37℃水浴1h以上。
　  （2）取反應(yīng)物點(diǎn)樣，觀察酶切效果。
　　（3）酶切完全后，70℃5min終止反應(yīng)。
　�。�4）加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。
　�。�5）15000rpm離心15min，棄上清。
　�。�6）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。
　�。�7）加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。
　�。�8）測定DNA的含量。
　�。�9）加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應(yīng)12～16h。
　�。�10）連接反應(yīng)液可置-20℃保存，供轉(zhuǎn)化用。