本法反應溫和,對抗原、抗體免疫活性影響小,已被廣泛應用。缺點是標記率較低,一般為20~40%。
1.原理此法是利用乳過氧化物酶(Lactoperoxidase)有促進微量過氧化氫對125I-的氧化作用,生成125I ,并標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上。
2.方法以標記蛋白質抗原為例。
(1)反應液組成:蛋白質2~5μg溶于磷酸緩沖液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);
(2)在室溫保溫7min;
(3)加入H2O2200ng(10μl);
(4)過7min再加入H2O2(3μl);
。5)保溫7min后,加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應;
。6)10min后加入NaI載體溶液1ml ;
。7)按常規方法分離純化。
3.注意事項
(1)LPO質量好壞,可直接影響標記率,LPO應在使用前新鮮配制,以防酶活性降低。
(2)LPO用量應小于總蛋白質用量的1%,以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質。
(3)碘化反應速率分析表明,酶的催化速度很快。
(4)碘化反應在pH4.0~8.5較寬范圍內均可進行,最適pH值應依據蛋白質本身性質而定。
。5)H2O2應保持低濃度,如高于0.1mmol/L,對酶的活性將有抑制作用。
1.原理此法是利用乳過氧化物酶(Lactoperoxidase)有促進微量過氧化氫對125I-的氧化作用,生成125I ,并標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上。
2.方法以標記蛋白質抗原為例。
(1)反應液組成:蛋白質2~5μg溶于磷酸緩沖液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);
(2)在室溫保溫7min;
(3)加入H2O2200ng(10μl);
(4)過7min再加入H2O2(3μl);
。5)保溫7min后,加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應;
。6)10min后加入NaI載體溶液1ml ;
。7)按常規方法分離純化。
3.注意事項
(1)LPO質量好壞,可直接影響標記率,LPO應在使用前新鮮配制,以防酶活性降低。
(2)LPO用量應小于總蛋白質用量的1%,以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質。
(3)碘化反應速率分析表明,酶的催化速度很快。
(4)碘化反應在pH4.0~8.5較寬范圍內均可進行,最適pH值應依據蛋白質本身性質而定。
。5)H2O2應保持低濃度,如高于0.1mmol/L,對酶的活性將有抑制作用。