小RNA（MicroRNA，miRNA）的作用與應用研究繼2001，2002連續兩年被美國《Science》雜志評選為年度10大突破技術以來，2003年繼續熱度高漲，名列前矛。其核心技術RNA干擾（RNAi），即用20多個核苷酸組成的短的雙鏈RNA（siRNA）代替傳統反義核酸進行轉錄后基因沉默，已經迅速而廣泛地應用到基因功能，基因表達調控機制研究等熱門領域，并為基因治療開辟了新的途徑。近兩年來，這方面的科學論文及報道爆炸性增長，幾乎每天都有新的結果涌現。此外，RNAi沉默機制的探索方面也取得了相當的進展。在大致勾畫出生物體內源性小RNA的重要作用框架后，2003年生物學家致力于闡述更進一步的細節，探索小RNA如何調控細胞的行為，如何利用RNAi機制進行疾病防治等等。以下就分幾個方面為大家介紹一些近幾年RNA干擾的主要研究領域及前沿進展。

一． 外源RNA誘導RNAi的應用

1. 基因功能研究
　　從2001年《Nature》雜志上首家報道在哺乳動物培養細胞中通過siRNA成功誘導了特異性靶基因表達沉默后，RNA干擾技術就作為一項特異性基因沉默的有效工具從低等生物成功進軍哺乳動物領域。2003年Rubinson DA等又在Nature Genetics上報道用病毒系統在原代哺乳動物細胞，干細胞和轉基因小鼠上都取得了RNA干擾成功，更大大擴展了這項技術的應用范圍。研究者們可以利用這項技術對目標基因進行特異性地表達沉默，通過觀察其表達被抑制后細胞以至生物體從形態到各項生理生化的變化，對該基因的功能及參與的信號網絡進行研究。這比傳統的基因敲除方法要簡單而且方便得多，因此短短幾年，就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相關的一些基因，不僅對疾病機制及相關代謝網絡有了進一步認識，也為基因治療及藥物篩選提供了一些借鑒。
　　在具體誘導方式方面，目前報道的成功的siRNA形式多樣，其中短發夾結構RNA（shRNA，short hairpin RNA）表達載體的應用大大加快了研究者從最初的培養細胞水平擴展到成體水平的步伐。例如，在神經生物學研究中，美國NIH的Backman C等通過siRNA表達質粒對中腦腹側神經細胞中的多巴胺能相關基因進行了有效抑制， Hommel JD等還通過病毒介導的RNAi建立了此類成年小鼠模型，不僅為建立神經系統的功能缺失模型找到了一些有價值的表型標記，對神經系統的基因治療也有一定借鑒意義；在癌癥研究中，Zhang Y等也通過shRNA表達載體成功抑制成年大鼠腦癌基因，并對RNAi的遠程（穿過血腦屏障）基因沉默方法進行了非常有益的探索；利用細胞凋亡途徑，Zender L等通過RNAi抑制凋亡基因Caspase－8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率，并發現Caspase 8 siRNA處理對特異性Fas 激活劑（Jo2和AdFasL）和野生型腺病毒介導的急性肝功能衰竭都有效，表明這個動物模型能反應人類急性病毒肝炎多分子參與的機制，增強了siRNA用于急性肝炎病人治療的希望……
除了對某些關鍵基因的RNAi研究外，Zheng L等還在哺乳動物細胞中探索了siRNA在基因組水平上的篩選方法。他們建立了一個包含8000多個基因的siRNA表達框文庫陣列，通過它來高通量篩選NF-kB信號途徑中已知的及Unique基因。由此可見，RNA干擾也正作為篩選成百甚至上千基因的工具，發揮著越來越大的作用。
　　總的來說，RNA干擾為系統地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相對簡便的途徑。通過在一段時間內對一個基因RNA信號的抑制，研究者可以深入研究基因功能，進而開始描繪支配從細胞形態到信號系統的遺傳網絡。

2. 基因治療及藥物篩選探索
　　由于RNA干擾是針對轉錄后階段的基因沉默，相對于傳統基因治療對基因水平上的敲除，整個流程設計更簡便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開辟了新的途徑。其總體思路是通過加強關鍵基因的RNAi機制，控制疾病中出現異常的蛋白合成進程或外源致病核酸的復制及表達。尤其針對引起一些對人類健康嚴重危害的核酸病毒，如去年在全球多個國家和地區流行的SARS這種主體是單鏈核酸的新型冠狀病毒，尋找藥物靶點，設計核酸藥物就更加方便。目前已經有很多公司在積極開發這方面的藥物，如在去年SARS藥物研究中一鳴驚人的美國俄勒岡州的AVI BioPharma生物制藥公司等。國內也有很多研究機構及生物技術公司投入了這方面的工作。如上海生科院成立了SARS防治科研攻關領導小組，其中生化細胞所和藥物所的一些課題組在從RNA干擾的角度努力。此外，北大，中南大學，北京動物所等大專院校研究機構以及北京金賽獅反義核酸技術開發有限公司等也開展了RNA干擾藥物的研究與開發。
　　基因治療方面去年最引人注目的進展之一是對肝炎的RNA干擾研究。McCaffrey AP等通過表達shRNA的載體在培養細胞水平和轉染HBV質粒后免疫活性缺失的小鼠肝臟中成功抑制了HBV復制。與對照相比，小鼠血清中測得的HBsAg下降84.5％，免疫組化對HBcAg的分析結果下降率更超過99%。另，哈佛大學Lieberman的研究小組通過注射針對Fas的siRNA，過度激活炎癥反應，誘導小鼠肝細胞自身混亂。然后給測試小鼠注入使Fas hyperdrive的抗體，發現未進行siRNA處理的對照組小鼠在幾天中死于急性肝功能衰竭，而82%的siRNA處理小鼠都存活下來，沒有患病，它們當中80-90％的肝細胞經證實結合了siRNA。并且，RNAi發揮功能達10天，三周后才完全衰退。由于Fas很少在肝細胞外的其它細胞高表達水平，對它的抑制對其它器官幾乎沒有副作用。 此外，這個小組還和其它研究者積極開展針對HIV的RNAi測試，目前報道他們使用的針對CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV進入免疫細胞約三周，在已經感染的細胞中也能阻止感染病毒的復制。
　　然而，盡管取得了不少成果，要真正用于醫療還需時日。目前大多數還停留在小鼠測試階段，siRNA的導入多采用靜脈或腹腔注射，尾部注射，細胞移植等，如何對人進行有效的給藥，既能確保藥效在靶器官靶組織有效釋放，還要具有高度安全性等等問題都尚需進一步研究。我們期待著RNAi引領的新醫學革命的到來
在藥物篩選領域，除了線蟲這種低等動物的RNAi高通量藥篩模式外，2003年Lavery KS等的綜述中也對RNAi在藥篩領域的應用前景進行了高度評價：RNAi技術將逐漸成為藥物靶點篩選和鑒定的強大工具。他對如何在藥篩的各個階段應用RNAi做了具體描述及展望，并指出將這項技術與高通量篩選，體外生物檢測和體內疾病模式相結合，將提供大量基因功能方面的有用信息，在藥物開發過程的多個階段促進靶點的篩選。

二． 內源RNAi機制及功能研究
　　是什么原因使我們有可能通過外源siRNA誘導內源性的靶基因轉錄后沉默？為解開這個迷題，更有效地進行RNAi應用，隨著RNAi應用研究的廣泛開展，生物體內部RNAi機制研究也愈加深入，并迅速成為RNAi研究中的重要領域，吸引著越來越多的研究者投身其中，涌現出一系列令人耳目一新的成果。
　　多年來，生物學家認為RNA在生命過程中的作用僅僅是將遺傳信息從DNA傳遞到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般沒有創意。但近幾年的一系列發現使研究者對RNA，尤其是mRNA以外的哪些小RNA的功能有了全新的認識。生物體中有一群小RNA（目前看來人體中編碼約255種小RNA，竟占整個基因組近1%，很多可能編碼自以前被認為“垃圾DNA”的區域），它們也可通過自身的RNAi機制，在生命過程的各個階段關閉或調控基因表達水平，從而控制細胞的多種生命活動。尤其在發育過程中2003年有一些激動人心的最新發現：僅約22個核苷酸長度的小RNA，發現竟能引導早期發育――從使植物葉片成形到介導果蠅胚胎在植物組織中的細胞增殖；缺少RNAi蛋白Dicer（一種RNA酶III家族的酶，參與RNAi過程中對RNA的剪切）的小鼠會缺少干細胞的某些分化系（swaths of stem cells），在出生前就夭折；小鼠中特定的小RNA能幫助引導干細胞生成胚胎的血細胞系統。
　　此外，有些RNAi現象能在DNA編碼不變的情況下傳代，甚至在一些物種中對基因組進行調整，有人形象地比喻它為“引導基因組的手”，生動體現了小RNA源于基因組但對基因組所具有的強大反饋作用。《Science》上一篇題為“RNAi Extends Its Reach”的綜述詳細闡述了RNAi途徑已經不僅僅限于沉默mRNA，還作用于基因組。這方面的具體機制還不是非常明確，但在植物中發現伴隨有DNA甲基化現象，科學家們預測要描繪一張完整的RNA引導基因組改變的圖譜可能需要對RNA信號，DNA甲基化和組蛋白修飾之間的相互作用進行更進一步的研究。
綜合來看，我們可將目前報道的內部RNAi機制可能的功能，大致分為以下幾類：

1. 抗病毒功能
　　Voinnet和Li等分別在植物和果蠅中發現了通過RNAi實現的抗外源核酸機制：被大多數RNA病毒啟動的RNAi可導致病毒基因組降解。例如在果蠅細胞中， Flock house virus (FHV)就能引發果蠅內部的RNAi反應，產生FHV特異性的siRNA來降解感染的FHV。

2. 基因調控
　　目前在人、蠕蟲，果蠅和植物等生物體中都發現了小RNA，有的通過結合3’非翻譯區（UTR ）和靶mRNA抑制mRNA翻譯，有的作為siRNA通過RNAi機制破壞靶基因轉錄本，對基因表達水平進行調控。

3. 染色質濃縮
　　內源的siRNA，一些小RNA可能通過使染色質濃縮調節基因表達。一些研究小組發現dsRNA結合到植物啟動子區域能通過一種使DNA甲基化的作用導致基因沉默；在蠕蟲體內檢測到許多Polycomb 蛋白（能結合染色質）是RNAi過程所必須的；裂殖酵母中內源siRNA可介導中心粒區染色質濃縮，導致這個位點的基因轉錄沉默。如Vera Schramke等在裂殖酵母中通過合成shRNA反式抑制同源位點，導致在mate區沉默的Swi6染色質濃縮。這些結果都提示一些內源性的siRNA通過導致染色質濃縮來調節基因水平。

4. 轉座子沉默
　　目前，兩方面的證據提示轉座子沉默涉及siRNA。其一，發現蠕蟲mut-7基因參與RNAi和轉位抑制。其二，從裂殖酵母的中心粒區也分離出siRNA，并檢測到這些siRNA介導此區內組蛋白甲基化。由于中心粒區包含重復序列――含轉座子片段，在一些減數分裂基因中也發現了通過其附近的逆轉錄轉座子LTR（長末端重復序列）介導的RNAi，推測在siRNA介導的中心粒區域的組蛋白甲基化可能源于古老的轉座子沉默作用。

5. 基因組重組
　　siRNA可能參與纖毛蟲，四膜蟲蟲體間結合時的基因重組。結合到重組序列的siRNA，在蟲體之間的結合過程中介導DNA缺失和染色體斷裂。有趣的是，在這些siRNA介導的程序性DNA刪除事件中，也發現需要重組區域組蛋白的甲基化。