真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程,因此mRNA的3’末端都帶有一段Poly A,這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同,如何獲得全長的cDNA,如何擴增由微量的mRNA逆轉錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到全長的cDNA(即RACE),曾經(jīng)是一個令人困擾的問題。
常見的做法是在合成cDNA的雙鏈后在兩端連上接頭,利用已知的接頭序列再進行擴增,或者是利用末端轉移酶在雙鏈cDNA的3’末端加上一連串的G或者C(或者A/T),再通過補齊粘末端,利用已知的兩頭序列進行擴增。但是這些方法不同程度的存在一些問題,比如接頭的連接效率非常有限,會導致部分信息的丟失,再加上這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品,需要經(jīng)過反復的純化,會損失很多有用的信息,特別是少量樣品中的低豐度信息,很大程度上會影響結果的準確性。另外由于mRNA容易部分降解,很難確定得到的cDNA是否就是全長的cDNA,還是cDNA的片斷。
SMART技術的出現(xiàn)是一個新的里程碑。這個稱作Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript(SMART),原理實際上非常簡單:在合成cDNA的反應中事先加入的3’末端帶Oligo(dG)的SMART引物,由于逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA,在到達mRNA的5’末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結構”,即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個(dC),SMART引物的Oligo(dG)與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板,逆轉錄酶會自動轉換模板,以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端,這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列,另一端有已知的SMART引物序列,合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由于有5’帽子結構的mRNA才能利用這個反應得到能擴增的cDNA,因此擴增得到的cDNA就是全長cDNA。
這個專利的方法是利用逆轉錄酶內(nèi)源的末端轉移酶活性,只要單管,一步即可完成,不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀,或者額外的酶反應,只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫,更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度,可以應用于直接擴增基因、構建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA(RACE),和用于芯片檢測的cDNA探針的擴增等。
我們在這里分別介紹幾個采用SMART技術的產(chǎn)品:
一、SMART PCR cDNA Synthesis Kit
這個試劑盒是采用SMART技術將少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA制備成可大量擴增的cDNA,提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一鏈Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和純化cDNA用的純化柱和對照RNA在內(nèi)的試劑。其中CDS引物是含有經(jīng)過修飾的Oligo(dT)的起始引物,能特異結合在mRNA加Poly A的位置,避免結果有過長的Poly A影響后繼的測序或者PCR反應,同時也可以作為PCR的3’引物。合成的cDNA可以直接進行對數(shù)擴增或者線性擴增,可以作為定量PCR的模板,也可以直接用于Clontech的抑制性消減雜交,構建cDNA文庫或者做反向Northern雜交(Virtual Northern Blot),還有用于芯片檢測的cDNA探針制備。
二、SMART cDNA Library Construction Kit
常規(guī)的建庫需要在合成的cDNA雙鏈兩端通過連接加上相同或者不同的adaptor,用相應的酶切后可以插入載體中。由于連接效率低往往導致低豐度或者是較長的cDNA信息的丟失,使文庫偏重高豐度和較短的基因,失去應有的代表性。在做表達文庫時,如果cDNA的兩端是同一個酶切位點,由于cDNA可能按兩個不同的方向接入載體,反向接入載體的那些cDNA不能正確表達,因而有50%的可能丟失。然而用兩個不同的Adaptor又會涉及雙酶切以及雙酶切是否完全的問題,影響產(chǎn)率。另外由于表達時3個堿基代表一個氨基酸,不同的表達框架會得到不同的產(chǎn)物,因此正向插入一個表達載體的cDNA只有1/3的可能得到正確的產(chǎn)物。雖然一度有ABC表達載體的解決方法,但是一段DNA同時插入3個載體的機會是有限的。
利用SMART技術建庫,可以得到全長的cDNA文庫,也不需要Adaptor的連接。這個試劑盒的SMART引物和CDS引物與前面的試劑盒略有不同,分別帶有一個不完全相同的SfiI酶切位點。SfiI是一個在真核生物基因組中極為稀少的酶,出現(xiàn)的頻率要遠遠小于NotI、EcoRI等識別6個堿基位點的酶。SfiI識別序列為GGCCNNNN^NGGCC,中間的5個堿基為任意序列。因而兩個引物分別帶有一個不完全相同的SfiI位點就是說兩個位點的中間5個堿基不同。這樣經(jīng)過SMART技術合成兩端分別帶有SMART引物和CDS引物的cDNA經(jīng)過擴增后用SfiI單酶切,得到的是兩端的粘端不同的cDNA,這樣就可以定向插入特定的載體中,不會浪費50%的信息。
這個試劑盒提供的載體也很有特色:lambdaTriplex2載體有特別設計,可以用3個不同的表達框架分別同時表達一段插入的DNA。這樣就保證插入的片斷的正確的表達產(chǎn)物能被篩選出來而不會漏掉。
三、SMART RACE cDNA Amplification Kit
對于DD-PCR或者SSH、RNA指紋、EST芯片等方法得到DNA片斷,要釣全長cDNA,或者用同源序列釣其他物種中的同源基因,3’端的擴增一般都不成問題,難就難在5’端的片斷擴增。利用SMART技術將SMART引物自動加入cDNA的5’端,不但能避免加接頭或者加一串堿基的麻煩,而且能得到全長的cDNA 5’端。只要少至25個堿基的已知序列即可釣出全長的cDNA。
四、Altas SMART Probe Amplification Kit
由于DNA芯片上的點多,每個點的樣品量很有限,要足夠的靈敏度需要有足夠多的探針。當制備探針的樣品來源有限時,這個試劑盒就是解決辦法之一:利用SMART技術可以將少至1000個細胞來源的RNA制備得到足夠的cDNA探針。得到的探針能代表mRNA原有的豐度,而且操作簡單。
五、即將推出的Super SMART PCR Kit能夠從少到2ng的Total RNA中制備多達1微克的cDNA!而且制備的探針靈敏度提高10倍、穩(wěn)定性較原有的試劑提高30%!詳細信息請留意生物通快訊。
總之,SMART技術是研究人員利用酶的天然屬性,經(jīng)巧妙設計而成為研究人員進行研究的有力武器。