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尋找差異表達基因方法--簡化SSH法

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-06

無論是從一個胚胎細胞分化為不同的組織器官,或者是從正常的組織突變為腫瘤組織,都可能涉及在同一基因組背景下不同基因的差異性表達。尋找差異表達的基因就有可能揭示細胞分化的機制或者腫瘤的成因,因而也就成為一項熱門的技術。

尋找差異表達的基因有不少方法,抑制消減雜交(SSH)是比較有效的一種方法。以Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kit為例:將樣品(tester)和對照(driver)的mRNA分別反轉錄并合成為雙鏈cDNA后進行酶消化;樣品(tester)分為兩組,分別加上不同的adaptor1/2;再將兩組樣品(tester)分別與過量的對照(driver)雜交,兩份雜交結果混合,加入過量的對照再進行第二輪雜交;補齊adaptor然后用PCR選擇性擴增。由于過量的對照封閉了在樣品中共同表達的基因,而在樣品中特異表達的基因會被選擇性地擴增出來,這些擴增的片斷經過克隆、測序后可以進行拼接或者用RACE的方法從已知片斷釣全長cDNA,再做進一步的分析。

但是這一系列的操作并不簡單,且得到的結果是一些基因片斷,還需要進行下一步的拼接或RACE才能得到完整的基因信息,現在介紹一種簡化的消減雜交的技術:以Miltenyi Biotec公司的μMACS mRNA Isolation Kit為例,在純化對照(driver)mRNA時先將組織裂解,加入耦聯了Oligo dT的磁珠懸液,混勻并立即加入放在磁場中的磁式分離柱中,磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并懸浮在磁場中,其它雜質隨溶液流出。加入新鮮的wash buffer反復淋洗干凈掛上mRNA的磁珠后,不用洗脫液洗脫mRNA,而是利用磁珠上的Oligo dT作為RT引物直接進行反轉錄反應,再用Elution buffer洗脫mRNA,得到耦聯在磁珠上的對照單鏈cDNA庫。這時將樣品(tester)的mRNA加入磁珠中,共同表達的基因對應的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁場中而特異表達的mRNA不被吸附隨溶液流出柱外,這部分溶液反復過柱后得到的就是差異表達的mRNA。其它的mRNA分離試劑也可有類似的用法,只是本文介紹的方法由于得到的mRNA純度高、完整且濃度高體積小,又是層析柱式的逐級淋洗使cDNA與mRNA吸附得更充分,所以假陽性較少。

這種方法得到的是全長的mRNA,可以直接得到全長的cDNA而無需拼接DNA片斷,且操作也較為簡單。至于效率或假陽性率則因人而異了。

 

 
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