重組DNA技術的建立與分子雜交相結合，從分子水平研究基因定位，發展了一系列有效方法。例如原位雜交（in situ hybridization）就是分子雜交技術在基因定位中的應用，也是一種直接進行基因定位的方法。分子雜交的基本原理是堿基的互補配對，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA鏈在一定條件下能結合成雙鏈，用放射性或非放射性物質標記的DNA或RNA分子作為探針，可探測到細胞基因組中的同源部分。原位雜交的特點是雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標本上進行。所謂原位即指標本上DNA原位變性，在利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針雜交后，通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區帶出現的最高頻率或熒光的強弱來確定探針的位置，從而進行準確的基因定位。
　　放射性同位素標記核酸探針與染色體顯帶結合進行原位雜交仍有不少缺點和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊實驗室，自顯影曝光時間長，同位素標記的探針不易保存，放射污染不利健康，特別是高質量的中期染色體標本在細胞培養基礎上難以得到，觀察費時，對間期核的研究難以進行等。熒光原位雜交（florescence in-situ hybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標記核酸（DNA）探針，可在染色體、細胞和組織切片標本上進行DNA雜交，對檢測細胞內DNA或RNA的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是將熒光染料與抗體蛋白結合進行檢測。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的分辯率。現已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多色FISH技術近年來發展迅速，已成為基因定位作圖和醫學診斷的重要手段。