根據蛋白質的形態、大小和電荷的不同而設計的物理分離方法。各種不同的層析方法都涉及共同的基本特點:有一個固定相和流動相，當蛋白質混合溶液(流動相)通過裝有珠狀或基質材料的管或柱(固定相)時，由于混合物中各組份在物理化學性質(如吸引力、溶解度、分子的形狀與大小、分子的電荷性與親和力)等方面的差異使各組分在兩相間進行反復多次的分配而得以分開。流動相的流動取決于引力和壓力，而不需要電流。用層析法可以純化得到非變性的、天然狀態的蛋白質。層析的方法很多，其中凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等是目前最常用的層析方法。