真核細(xì)胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3'末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA文庫的基礎(chǔ)。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴(kuò)增由微量的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到全長的cDNA（即RACE），曾經(jīng)是一個令人困擾的問題。
常見的做法是在合成cDNA的雙鏈后在兩端連上接頭，利用已知的接頭序列再進(jìn)行擴(kuò)增，或者是利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA的3'末端加上一連串的G或者C（或者A/T），再通過補(bǔ)齊粘末端，利用已知的兩頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。但是這些方法不同程度的存在一些問題，比如接頭的連接效率非常有限，會導(dǎo)致部分信息的丟失，再加上這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品，需要經(jīng)過反復(fù)的純化，會損失很多有用的信息，特別是少量樣品中的低豐度信息，很大程度上會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外由于mRNA容易部分降解，很難確定得到的cDNA是否就是全長的cDNA，還是cDNA的片斷。
SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個新的里程碑。這個稱作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理實(shí)際上非常簡單：在合成cDNA的反應(yīng)中事先加入的3'末端帶Oligo（dG）的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達(dá)mRNA的5'末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”，即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個（dC），SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會自動轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有5'帽子結(jié)構(gòu)的mRNA才能利用這個反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA，因此擴(kuò)增得到的cDNA就是全長cDNA。
這個專利的方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性，只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應(yīng)，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA（RACE），和用于芯片檢測的cDNA探針的擴(kuò)增等。
一、SMART PCR cDNA Synthesis Kit
這個試劑盒是采用SMART技術(shù)將少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA制備成可大量擴(kuò)增的cDNA，提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一鏈Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和純化cDNA用的純化柱和對照RNA在內(nèi)的試劑。其中CDS引物是含有經(jīng)過修飾的Oligo（dT）的起始引物，能特異結(jié)合在mRNA加Poly A的位置，避免結(jié)果有過長的Poly A影響后繼的測序或者PCR反應(yīng)，同時也可以作為PCR的3'引物。合成的cDNA可以直接進(jìn)行對數(shù)擴(kuò)增或者線性擴(kuò)增，可以作為定量PCR的模板，也可以直接用于Clontech的抑制性消減雜交，構(gòu)建cDNA文庫或者做反向Northern雜交（Virtual Northern Blot），還有用于芯片檢測的cDNA探針制備。
二、SMART cDNA Library Construction Kit
常規(guī)的建庫需要在合成的cDNA雙鏈兩端通過連接加上相同或者不同的adaptor，用相應(yīng)的酶切后可以插入載體中。由于連接效率低往往導(dǎo)致低豐度或者是較長的cDNA信息的丟失，使文庫偏重高豐度和較短的基因，失去應(yīng)有的代表性。在做表達(dá)文庫時，如果cDNA的兩端是同一個酶切位點(diǎn)，由于cDNA可能按兩個不同的方向接入載體，反向接入載體的那些cDNA不能正確表達(dá)，因而有50%的可能丟失。然而用兩個不同的Adaptor又會涉及雙酶切以及雙酶切是否完全的問題，影響產(chǎn)率。另外由于表達(dá)時3個堿基代表一個氨基酸，不同的表達(dá)框架會得到不同的產(chǎn)物，因此正向插入一個表達(dá)載體的cDNA只有1/3的可能得到正確的產(chǎn)物。雖然一度有ABC表達(dá)載體的解決方法，但是一段DNA同時插入3個載體的機(jī)會是有限的。
利用SMART技術(shù)建庫，可以得到全長的cDNA文庫，也不需要Adaptor的連接。這個試劑盒的SMART引物和CDS引物與前面的試劑盒略有不同，分別帶有一個不完全相同的SfiI酶切位點(diǎn)。SfiI是一個在真核生物基因組中極為稀少的酶，出現(xiàn)的頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于NotI、EcoRI等識別6個堿基位點(diǎn)的酶。SfiI識別序列為GGCCNNNN^NGGCC，中間的5個堿基為任意序列。因而兩個引物分別帶有一個不完全相同的SfiI位點(diǎn)就是說兩個位點(diǎn)的中間5個堿基不同。這樣經(jīng)過SMART技術(shù)合成兩端分別帶有SMART引物和CDS引物的cDNA經(jīng)過擴(kuò)增后用SfiI單酶切，得到的是兩端的粘端不同的cDNA，這樣就可以定向插入特定的載體中，不會浪費(fèi)50%的信息。
這個試劑盒提供的載體也很有特色：lambdaTriplex2載體有特別設(shè)計，可以用3個不同的表達(dá)框架分別同時表達(dá)一段插入的DNA。這樣就保證插入的片斷的正確的表達(dá)產(chǎn)物能被篩選出來而不會漏掉。
三、SMART RACE cDNA Amplification Kit
對于DD-PCR或者SSH、RNA指紋、EST芯片等方法得到DNA片斷，要釣全長cDNA，或者用同源序列釣其他物種中的同源基因，3'端的擴(kuò)增一般都不成問題，難就難在5'端的片斷擴(kuò)增。利用SMART技術(shù)將SMART引物自動加入cDNA的5'端，不但能避免加接頭或者加一串堿基的麻煩，而且能得到全長的cDNA 5'端。只要少至25個堿基的已知序列即可釣出全長的cDNA。
四、Altas SMART Probe Amplification Kit
由于DNA芯片上的點(diǎn)多，每個點(diǎn)的樣品量很有限，要足夠的靈敏度需要有足夠多的探針。當(dāng)制備探針的樣品來源有限時，這個試劑盒就是解決辦法之一：利用SMART技術(shù)可以將少至1000個細(xì)胞來源的RNA制備得到足夠的cDNA探針。得到的探針能代表mRNA原有的豐度，而且操作簡單。
常見的做法是在合成cDNA的雙鏈后在兩端連上接頭，利用已知的接頭序列再進(jìn)行擴(kuò)增，或者是利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA的3'末端加上一連串的G或者C（或者A/T），再通過補(bǔ)齊粘末端，利用已知的兩頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。但是這些方法不同程度的存在一些問題，比如接頭的連接效率非常有限，會導(dǎo)致部分信息的丟失，再加上這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品，需要經(jīng)過反復(fù)的純化，會損失很多有用的信息，特別是少量樣品中的低豐度信息，很大程度上會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外由于mRNA容易部分降解，很難確定得到的cDNA是否就是全長的cDNA，還是cDNA的片斷。
SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個新的里程碑。這個稱作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理實(shí)際上非常簡單：在合成cDNA的反應(yīng)中事先加入的3'末端帶Oligo（dG）的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達(dá)mRNA的5'末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”，即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個（dC），SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會自動轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有5'帽子結(jié)構(gòu)的mRNA才能利用這個反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA，因此擴(kuò)增得到的cDNA就是全長cDNA。
這個專利的方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性，只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應(yīng)，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA（RACE），和用于芯片檢測的cDNA探針的擴(kuò)增等。
一、SMART PCR cDNA Synthesis Kit
這個試劑盒是采用SMART技術(shù)將少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA制備成可大量擴(kuò)增的cDNA，提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一鏈Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和純化cDNA用的純化柱和對照RNA在內(nèi)的試劑。其中CDS引物是含有經(jīng)過修飾的Oligo（dT）的起始引物，能特異結(jié)合在mRNA加Poly A的位置，避免結(jié)果有過長的Poly A影響后繼的測序或者PCR反應(yīng)，同時也可以作為PCR的3'引物。合成的cDNA可以直接進(jìn)行對數(shù)擴(kuò)增或者線性擴(kuò)增，可以作為定量PCR的模板，也可以直接用于Clontech的抑制性消減雜交，構(gòu)建cDNA文庫或者做反向Northern雜交（Virtual Northern Blot），還有用于芯片檢測的cDNA探針制備。
二、SMART cDNA Library Construction Kit
常規(guī)的建庫需要在合成的cDNA雙鏈兩端通過連接加上相同或者不同的adaptor，用相應(yīng)的酶切后可以插入載體中。由于連接效率低往往導(dǎo)致低豐度或者是較長的cDNA信息的丟失，使文庫偏重高豐度和較短的基因，失去應(yīng)有的代表性。在做表達(dá)文庫時，如果cDNA的兩端是同一個酶切位點(diǎn)，由于cDNA可能按兩個不同的方向接入載體，反向接入載體的那些cDNA不能正確表達(dá)，因而有50%的可能丟失。然而用兩個不同的Adaptor又會涉及雙酶切以及雙酶切是否完全的問題，影響產(chǎn)率。另外由于表達(dá)時3個堿基代表一個氨基酸，不同的表達(dá)框架會得到不同的產(chǎn)物，因此正向插入一個表達(dá)載體的cDNA只有1/3的可能得到正確的產(chǎn)物。雖然一度有ABC表達(dá)載體的解決方法，但是一段DNA同時插入3個載體的機(jī)會是有限的。
利用SMART技術(shù)建庫，可以得到全長的cDNA文庫，也不需要Adaptor的連接。這個試劑盒的SMART引物和CDS引物與前面的試劑盒略有不同，分別帶有一個不完全相同的SfiI酶切位點(diǎn)。SfiI是一個在真核生物基因組中極為稀少的酶，出現(xiàn)的頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于NotI、EcoRI等識別6個堿基位點(diǎn)的酶。SfiI識別序列為GGCCNNNN^NGGCC，中間的5個堿基為任意序列。因而兩個引物分別帶有一個不完全相同的SfiI位點(diǎn)就是說兩個位點(diǎn)的中間5個堿基不同。這樣經(jīng)過SMART技術(shù)合成兩端分別帶有SMART引物和CDS引物的cDNA經(jīng)過擴(kuò)增后用SfiI單酶切，得到的是兩端的粘端不同的cDNA，這樣就可以定向插入特定的載體中，不會浪費(fèi)50%的信息。
這個試劑盒提供的載體也很有特色：lambdaTriplex2載體有特別設(shè)計，可以用3個不同的表達(dá)框架分別同時表達(dá)一段插入的DNA。這樣就保證插入的片斷的正確的表達(dá)產(chǎn)物能被篩選出來而不會漏掉。
三、SMART RACE cDNA Amplification Kit
對于DD-PCR或者SSH、RNA指紋、EST芯片等方法得到DNA片斷，要釣全長cDNA，或者用同源序列釣其他物種中的同源基因，3'端的擴(kuò)增一般都不成問題，難就難在5'端的片斷擴(kuò)增。利用SMART技術(shù)將SMART引物自動加入cDNA的5'端，不但能避免加接頭或者加一串堿基的麻煩，而且能得到全長的cDNA 5'端。只要少至25個堿基的已知序列即可釣出全長的cDNA。
四、Altas SMART Probe Amplification Kit
由于DNA芯片上的點(diǎn)多，每個點(diǎn)的樣品量很有限，要足夠的靈敏度需要有足夠多的探針。當(dāng)制備探針的樣品來源有限時，這個試劑盒就是解決辦法之一：利用SMART技術(shù)可以將少至1000個細(xì)胞來源的RNA制備得到足夠的cDNA探針。得到的探針能代表mRNA原有的豐度，而且操作簡單。
