等電點聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當蛋白質放進此體系時，不同的蛋白質即移動到或聚焦于與其等電點相當的pH位置上，電聚焦的優點是：有很高的分辨率，可將等電點相差0.01-0.02pH單位的蛋白質分開；一般電泳由于受擴散作用的影響，隨著時間和所走的距離加長，區帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴散作用，使區帶越走越窄；由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其電點，很稀的樣品也可進行分離；可直接測出蛋白質的等電點，其精確度可達0.01pH單位。電聚焦技術的缺點是：一是電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質可能發生沉淀，二 是樣品中的成分必需停留于其等電點，不適用在等電點不溶或發生變性的蛋白質。

　　電聚焦技術要求有穩定的pH梯度，要求極防止對流和防止已分離區帶再混合的措施，其辦法有三：密度梯度，聚丙烯酰胺凝膠和區帶對流聚焦，以第一種方法為常用。

一、基本原理

（1）人工pH梯度：在分離蛋白質時常用一個直立的性，以蔗糖密度梯度防止對流。當兩個不同pH的緩沖液互相擴散時，在其混合區間即形成pH梯度，稱為“人工pH梯度”。因為緩沖液是電解質，在電場中的它的離子移動會引起pH梯度的改變，所以不穩定。

（2）天然pH梯度：這種梯度是由電流本身所引起并保持的，比較穩定，其形成過程是，當電解硫酸鈉的稀溶液時，在陽極聚焦硫酸而在陰極聚焦氫氧化鈉。若將一些兩性電解質放入槽中，則它們在陽極的酸性介質中就會得到質子而帶正電，在陰極的堿性介質中則失掉質子而帶負電，這樣就會受其附近的電極所排斥而向相反方向移動。設其中有一個酸性最強的兩性電解質（甲），當它由陰極逐漸接近陽極的硫酸時，就會失去電荷而停止運動，（甲）所在的位置就是它的等電點，另有一個等電點稍高于（甲）的物質（乙)，當向陽極運動靠近（甲）時，它不能超過（甲），因為那里低于它的等電點。于是（乙)將帶正電荷而向陰極移動，它只能排要（甲）的陰極側。假如有很多兩性電解質，它們就會按照等電點由低到高的順序依次排列，形成一個由陽極向陰極逐步升高的平穩的pH梯度，此梯度的進程取決于兩性電解質的pH值，濃度和緩沖性質。防止對流的情況下，只要電流穩定，這個pH梯度將保持不變。

（3）兩性電解質互相分離的條件：上述經驗甲乙兩物質形成兩個相鄰的不同pH的等電點層，因為在它們中間不能形成純水層，所以它們不是完全分離開的，中間部分互相擴散，互相粘連。要使兩物質完全分開，中間必須有一個介于其間pH值的物質，例如，當甲乙兩物質的pH值正好一個在7以下，一個在7以上，即可以分開，因為中間形成了純水層（pH=7)，這時水是作為一個兩性電解質而存在。

（4）蛋白質的電聚焦分離：蛋白質及多肽是兩性電解質，它們比氨基酸更適于電聚焦，因為它們在等電點附近仍有電荷而能進行電遷移，大部分中性氨基酸在接近等電點時就失去電荷而停止運動，不能過到真正的等電點。但在沒有第三種居間的兩性電解質存在時也不能將兩種蛋白質完全分開，必須有很多不同pH值的是電解質（載體兩性電解質）才能解決這個問題。

二、載體兩性電解質

（1）載體兩性電解質必需具備的條件：
（i）在等電點處必需有足夠的緩沖能力，以便能控制pH梯度，而不致被樣品蛋白質或其他兩性物質的緩沖能力改變pH梯度的進程。
（ii）在等電點必需的足夠高電導，以便使一定的電流通過，而且要求具備不同pH值的載體有相同的電導系數，使整個體系中的電導均勻，如果有局部電導過小，就會產生極大的電位降，從而其他部分電壓就會太小，以致不能保持梯度，也不能使應聚焦的成分進行電遷移，達到聚焦。
（iii）分子量要小，便于與被分離的高分子物質用透析或凝膠過濾法分開。
（iv）化學組成應不同于被分離物質，不干擾測定。
（v）應不與分離物質反應或使之變性。總起來說，當一個兩性電解質的等電點介于兩個很近的pk值之間時，它在等電點的解離度大，緩沖能力強，而且電導系數高，這 就是好的載體兩性電解質。

（2）理想的載體兩性電解質的合成：

　　用具有幾個pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）為原料，與不飽和酸（如丙烯酸）發生加合反應：加合反應優先加在α、β飽和酸的β碳原子上，調節胺和酸的比例可以加上一個或多個羧基，這種合成方法與一般有機會合成不同，有機合成一般要求合成的產物愈純愈好，而這里要求合成出的產物愈復雜愈好，要有多異構物和同系物，以保證的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，從而得到平滑的pH梯度。載體兩性電解質的等電點在pH3-10的范圍，分子量在300-1000之間，它們的緩沖能力等于或優于組氨酸，電導性能良好，可以使電場強度分布較均勻，它們的水溶性良好，在1%水溶液中的紫外吸收值（260mμ）很低。

三、密度梯度等電點聚焦

（一）密度梯度

　　密度梯度是用以防止對流保持pH梯度，避免已分離物質再混合的重要措施則由重溶液和輕溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶質應具有以下條件：溶解度高，粘度低；密度大，得到的密度差不低于0.12克/厘米3，不與樣品蛋白質起反應，不解離。最常用的是蔗糖（分析純），它對蛋白質不僅無害還有保護作用。重溶液含蔗糖50%（W/V)，這時柱上和柱下最大密度差為0.2克/厘米3，濃度太高則粘度過大適用。蔗糖在高pH值時會分解，影響pH梯度及pI值測定，這種情況下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。

（二）pH梯度的選擇

　　在測定未知蛋白時，可先采用pH3-10的載體，經初步測定后改用較窄的以提高分辨率，在使用pH7以上或以下范圍時，因缺少中性載體，在聚焦過程中載體與電極之間在pH7部位就會形成純水區帶，純水的電導極低，必須避免此現象。凡使用離開中性的pH范圍的載體時應加入相當于0.1載體量的pH6-8或pH3-10的載體。在用pH低于3的范圍時，可加有機酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH離于10時，可補加胺使pH增加到11。載體在pH6附近電導較低，可以與蔗糖密度梯度互相補償，蔗糖濃度高時電導低，所以可把pH6電導低部位放在柱上部，也就是用pH6以下范圍時，陰極在上，而用pH6以上范圍時，陽極在上方。

（三）蛋白質樣品及分離容量

　　電聚焦有高的分辨力，一般樣品不需提純，分析上可用來測定混合物中某一成分的相對比例：如大量提純蛋白質，則應預先初步提純。有些物質（如核酸）聚焦時會沉淀，應預先除去。蛋白質應不含鹽，因鹽濃度高電流大，易發熱，而且鹽離子遷移至兩極產生酸堿，占據了分離的有效部位。加樣體積不受限制，最高可達80-85毫升。 　　等電點聚焦的分離容量受下列幾個因素影響：聚焦后每一區帶的蛋白量取決于密度梯度所能支持的蛋白質，提高密度可以提高分離容量；容量與區帶高度的平方成正比，降低電壓可使區帶變寬，提高容量，但分辨率降低，聚焦時間長，用窄的pH梯長范圍可以使區帶變寬，提高分辨率。用110毫升柱時，每一區帶蛋白質含量最高可達２0-25毫克，由于粗蛋白樣品可分為很多區帶，所以總量可以加至幾百毫克；分離的容量與柱的橫載面成正比，用440毫克柱時，可加粗蛋白質5克，每一區帶可達一克。