一、概要
慶大霉素(Gentamicin, GEN)屬于氨基糖甙類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細菌，由于其抗菌譜廣、療效佳且價格低廉而廣泛應用于獸醫臨床和動物飼料添加劑。但GEN的血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應用過程中易產生毒副作用，尤其大劑量不規范使用，易導致動物性食品中GEN殘留超標，對人體健康構成危害，對腦神經、聽覺以及腎臟的損害嚴重�，F有的檢測慶大霉素方法如色譜法或色譜-質譜聯用技術其樣品前處理復雜、所需儀器昂貴、操作復雜、耗費時間。而使用慶大霉素ELISA試劑盒能夠既快速又準確的分析樣品中慶大霉素殘留。
本試劑盒是應用ELISA技術研發而成的檢測產品，操作時間短于50min，能最大限度地減少操作誤差和工作強度。

二、試驗原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被慶大霉素抗原，樣品殘留的慶大霉素和微孔條上預包被的抗原競爭抗慶大霉素抗體，加入酶標二抗后，加入TMB底物顯色，樣品吸光值與其殘留物慶大霉素成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中慶大霉素的含量。

三、適用范圍
可定性、定量檢測牛奶、動物組織等樣品中慶大霉素的殘留量。

四、交叉反應率
慶大霉素……………………………………………………100％

五、檢測步驟
測定前應須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣品孔所在的位置。
5  加標準品/樣品：加標準品/樣品50l/孔到對應的微孔中，然后加入慶大霉素抗試劑50l/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300l/孔，充分洗滌5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標物：加入慶大霉素酶標物100l/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30min，取出重復洗板步驟6。
8、顯色：加入底物液A液50l/孔，再加底物液B液50l/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應15～20min。
9、測定：加入終止液50l/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據），測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。
六、檢測方法靈敏度、準確度、精密度
試劑盒靈敏度：0.1ppb
樣品最低檢測限：
組織………………………………………………3ppb
牛奶……………………………………………  3.5ppb
回收率：
組織…………………………………………………80±10%
牛奶………………………………………………… 80±10%
精密度：
試劑盒的變異系數均小于10%

七、注意事項
1、室溫低于20℃或試劑及樣品沒有回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、每加一種試劑前需將其搖勻。
4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件
保存試劑盒于2～8℃，不要冷凍，將不用的酶標板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質的跡象發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。
8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為15～20min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到30min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。
9、該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。


八、貯藏條件及保存期
貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。
保存期：該產品有效期為12個月。