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菌種活化就是將保藏狀態的菌種放入適宜的培養基中培養，逐級擴大培養得到純而壯的培養物，即獲得活力旺盛的、接種數量足夠的培養物。菌種發酵有一般需要2-3代的復壯過程，因為保存時的條件往往和培養時的條件不相同，所以要活化，讓菌種逐漸適應培養環境。
一般菌種臨時存放及活化
1. 低溫保存管應存放于－20℃~－80℃之低溫條件下。
2. 準備37℃之70﹪酒精浴槽（只能在電氣水浴槽中改放酒精，不可以火加溫，以免危險；若以37℃水浴取代，應避免水中微生物污染），其中事先安放小試管架，液面不可高達管塞。
3. 將低溫保存管從低溫保存條件中取出，置于37℃浴槽之小試管架上。
4. 不斷輕微搖動低溫保存管，液面不可高至管塞，直至結冰完全溶解（約需2分鐘）。
無菌培養
1.用無菌微量吸管，從已溶解之低溫保存管 吸取 1-2滴之菌液，滴入固態指定培養基某一邊緣附近，以劃線法接種于培養基。
2.將接種好的培養基置于指定溫度的培養箱中培養。
平板劃線分離法
平板劃線分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環在平板培養基表面通過分區劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞，經培養后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當作待分離微生物的純種。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。
1.手持金屬接種環，用酒精燈將接種環（共約5cm）燒至火紅，并不斷來回燒烤金屬固定桿之前約10公分，等待約10秒鐘，將接種環前端輕觸培養基邊緣凝膠（無菌體部份），待接種環完全冷卻后，以環沾黏菌滴，由培養基邊緣向中央輕輕橫劃緊接的并行線，直到涵蓋1/3培養基為止。
2.灼燒接種環，待數秒冷卻后，旋轉培養基自I區涂布的邊緣再橫劃數條線到未接種的區域。
3.重復2的動作完成。
4.灼燒接種環，將接種環歸位。
（1）金屬接種環
（2）平板劃線法
一般操作過程
1.在無菌操作下，用無菌微量吸管，從已溶解的管中吸取50μL（或1-2滴）的菌液，滴入固態指定培養基（培養基編號及溫度示于菌株訂購單）某一邊緣附近，以劃線法接種于培養基。
2.將接種好的培養基置于指定溫度的培養箱中培養。
3.在無菌環境下，以沾有75%酒精的棉花擦拭外管，在火焰上加熱外管之尖端。滴數滴無菌水于加熱處，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。取出隔熱纖維紙和內管，以滅菌過的鑷子取出內管之棉塞。
4.（a）適用于細菌用無菌吸管，吸取0.3-0.5mL指定之液體培養基，滴入內管內，并輕微震蕩（可用該吸管協助），直到均勻懸浮。
（b）適用于霉菌、酵母菌用無菌吸管，吸取0.3-0.5mL無菌水，滴入內管內，待干燥粉末溶解后，以無菌吸管吸取并滴入約含有5ml無菌水之試管內，輕微震蕩使其均勻后，靜置30至60分鐘。
5.取0.1-0.2mL之菌體懸浮液于指定的平板培養基上，做劃線分離培養或做成一系列之稀釋，用無菌L型玻棒均勻涂抹，以檢驗菌種之純度及活化情形，而剩余的菌體則全部移入指定的液體培養基內，并依指定的溫度培養之。
6.某些菌種經過冷凍干燥保存后，遲滯期(lagperiod)較長，必須等培養二倍時間后才能長出，且再經過一、二次繼代培養(Subculture)后才能正常生長。經過以上的努力后仍培養失敗，才視為不能活化。
