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開發(fā)方法或方法驗(yàn)證時(shí)最重要的一步就是流動(dòng)相的選擇和比例的調(diào)整。我想大家肯定都遇到過(guò)分離度不好或峰形不好的情況，大部分原因就是流動(dòng)相沒調(diào)好，那到底該怎么調(diào)，怎么選擇呢？看完下文可能你就知道答案了。
01 由強(qiáng)到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
02三倍規(guī)則
每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。
03 粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)
當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。
1、流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：
①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。
③必須與檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應(yīng)<2cp）。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng)。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
2．流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個(gè)乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發(fā)的無(wú)色液體，有氨的氣味。熔點(diǎn)－114.7℃，沸點(diǎn)89.3℃，相對(duì)密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。三乙胺有堿性，與無(wú)機(jī)酸能生成易溶于水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應(yīng)制取，也可用乙醇胺進(jìn)行氣相烷基化反應(yīng)合成。用于制橡膠硫化促進(jìn)劑、潤(rùn)濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級(jí)銨化合物。
3. 如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前，應(yīng)先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個(gè)PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個(gè)單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉(zhuǎn)變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由HH公示得知，當(dāng)溶液PH值等于2.2時(shí)，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2時(shí)99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當(dāng)緩沖液PH值等于2.2時(shí)，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱。
4．流動(dòng)相的脫氣HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無(wú)法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。
此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來(lái)誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。
除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來(lái)。此外還有在線脫氣機(jī)。
一般說(shuō)來(lái)有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動(dòng)相的濾過(guò)所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾過(guò)，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過(guò)”）。用濾膜過(guò)濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過(guò)濾有機(jī)溶劑，過(guò)濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過(guò)濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過(guò)，如需混合后濾過(guò)，首選有機(jī)相濾膜�，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。
6．流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過(guò)。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現(xiàn)象。
7．鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問(wèn)題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶�？傊u代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)產(chǎn)生類似問(wèn)題。
04 流動(dòng)相溶劑的選擇
1.所選用的流動(dòng)相溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，不與固定相和樣品組分起反應(yīng)，其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過(guò)程的穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。
2.溶劑應(yīng)當(dāng)不干擾檢測(cè)器的工作，溶劑應(yīng)與檢測(cè)器匹配，選擇不影響檢測(cè)器正常工作應(yīng)選擇在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)吸收的流動(dòng)相。
3.在制備分離中, 溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去, 不干擾對(duì)分離組分的回收。
4.溶劑的粘度要小，保證合適的柱壓降。
5.從實(shí)用角度考慮，溶劑應(yīng)當(dāng)價(jià)格低廉，容易購(gòu)得，使用安全，純度要高。
05 流動(dòng)相溶劑使用的注意事項(xiàng)
1.流動(dòng)相溶劑應(yīng)選擇HPLC的溶劑或依此為標(biāo)準(zhǔn)的溶劑。流動(dòng)相使用前用0.45μm濾膜過(guò)濾、脫氣，清除微粒和灰塵。在送液泵內(nèi)，為了防止雜物（固體）進(jìn)入流路，裝有吸濾器，但網(wǎng)孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過(guò)，這會(huì)導(dǎo)致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相溶劑須經(jīng)脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時(shí)，或壓力溫度變化時(shí)容易產(chǎn)生大量氣泡，會(huì)導(dǎo)致泵誤動(dòng)作和輸液不暢，檢測(cè)器產(chǎn)生噪聲信號(hào)等。
2.流動(dòng)相恢復(fù)到室溫后使用。流動(dòng)相溫度與室溫相差時(shí)，流動(dòng)相在恢復(fù)到室溫前，基線水平很難穩(wěn)定，特別是發(fā)生漂移，也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機(jī)溶劑混合時(shí)，混合液變化大，往往會(huì)與室溫相差很大，務(wù)必注意。
3.做HPLC流動(dòng)相的試劑應(yīng)用HPLC級(jí)的、水應(yīng)用二次蒸餾水，水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換，防止長(zhǎng)菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水（炊用）并不合適、尤其是做梯度洗脫時(shí)，水中的不純物會(huì)成為鬼峰，從而干擾分析結(jié)果。
4.流動(dòng)相的pH值過(guò)高或過(guò)低，流動(dòng)相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對(duì)試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞，這種對(duì)色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的。
5.用緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí)，在使用前和使用后都要用水清洗流路，絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
6.若需要使用含鹽的流動(dòng)相，使用前請(qǐng)務(wù)必過(guò)濾。并且使用該含鹽流動(dòng)相前，色譜柱需先用低比例有機(jī)相（有機(jī)相含量應(yīng)不低于10%）的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動(dòng)相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，以免流動(dòng)相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
7.進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意梯度變化過(guò)程中流動(dòng)相的互溶性，避免因流動(dòng)相不互溶而導(dǎo)致的緩沖鹽析出問(wèn)題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時(shí)，用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲(chǔ)存流動(dòng)相后在接柱子。
8.在更換兩種互不相溶的流動(dòng)相時(shí)，中間要用異丙醇溶液清洗過(guò)渡。例如：先用甲醇水做流動(dòng)相，然后在用正己烷做流動(dòng)相時(shí)，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動(dòng)相時(shí)還要考慮色譜柱是否更換。
9.儀器在短期（兩三天）不用時(shí)，流路中可以是甲醇或水。儀器在長(zhǎng)期不用時(shí)，流路中應(yīng)用甲醇。
10.對(duì)于UV等檢測(cè)器用于高靈敏度檢測(cè)時(shí)，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動(dòng)相溶劑，如甲醇、乙腈等。
11.當(dāng)流動(dòng)相溶劑為乙腈時(shí)，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大，導(dǎo)致泵的流速降低。可適當(dāng)提高流速使泵的壓力恢復(fù)正常即可。
12.流動(dòng)相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會(huì)對(duì)流路中的PEEK樹脂管路強(qiáng)度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動(dòng)相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對(duì)流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時(shí)，分析完了后，應(yīng)立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
13.用于檢定梯度等性能時(shí)，短時(shí)間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問(wèn)題的。
14.注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會(huì)引起爆炸。
06 液相色譜流動(dòng)相的貯存
流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過(guò)。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現(xiàn)象。
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01 由強(qiáng)到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
02三倍規(guī)則
每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。
03 粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)
當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。
1、流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：
①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。
③必須與檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應(yīng)<2cp）。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng)。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
2．流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個(gè)乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發(fā)的無(wú)色液體，有氨的氣味。熔點(diǎn)－114.7℃，沸點(diǎn)89.3℃，相對(duì)密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。三乙胺有堿性，與無(wú)機(jī)酸能生成易溶于水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應(yīng)制取，也可用乙醇胺進(jìn)行氣相烷基化反應(yīng)合成。用于制橡膠硫化促進(jìn)劑、潤(rùn)濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級(jí)銨化合物。
3. 如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前，應(yīng)先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個(gè)PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個(gè)單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉(zhuǎn)變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由HH公示得知，當(dāng)溶液PH值等于2.2時(shí)，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2時(shí)99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當(dāng)緩沖液PH值等于2.2時(shí)，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱。
4．流動(dòng)相的脫氣HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無(wú)法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。
此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來(lái)誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。
除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來(lái)。此外還有在線脫氣機(jī)。
一般說(shuō)來(lái)有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動(dòng)相的濾過(guò)所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾過(guò)，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過(guò)”）。用濾膜過(guò)濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過(guò)濾有機(jī)溶劑，過(guò)濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過(guò)濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過(guò)，如需混合后濾過(guò)，首選有機(jī)相濾膜�，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。
6．流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過(guò)。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現(xiàn)象。
7．鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問(wèn)題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶�？傊u代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)產(chǎn)生類似問(wèn)題。
04 流動(dòng)相溶劑的選擇
1.所選用的流動(dòng)相溶劑要有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，不與固定相和樣品組分起反應(yīng)，其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過(guò)程的穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。
2.溶劑應(yīng)當(dāng)不干擾檢測(cè)器的工作，溶劑應(yīng)與檢測(cè)器匹配，選擇不影響檢測(cè)器正常工作應(yīng)選擇在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)吸收的流動(dòng)相。
3.在制備分離中, 溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去, 不干擾對(duì)分離組分的回收。
4.溶劑的粘度要小，保證合適的柱壓降。
5.從實(shí)用角度考慮，溶劑應(yīng)當(dāng)價(jià)格低廉，容易購(gòu)得，使用安全，純度要高。
05 流動(dòng)相溶劑使用的注意事項(xiàng)
1.流動(dòng)相溶劑應(yīng)選擇HPLC的溶劑或依此為標(biāo)準(zhǔn)的溶劑。流動(dòng)相使用前用0.45μm濾膜過(guò)濾、脫氣，清除微粒和灰塵。在送液泵內(nèi)，為了防止雜物（固體）進(jìn)入流路，裝有吸濾器，但網(wǎng)孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過(guò)，這會(huì)導(dǎo)致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相溶劑須經(jīng)脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時(shí)，或壓力溫度變化時(shí)容易產(chǎn)生大量氣泡，會(huì)導(dǎo)致泵誤動(dòng)作和輸液不暢，檢測(cè)器產(chǎn)生噪聲信號(hào)等。
2.流動(dòng)相恢復(fù)到室溫后使用。流動(dòng)相溫度與室溫相差時(shí)，流動(dòng)相在恢復(fù)到室溫前，基線水平很難穩(wěn)定，特別是發(fā)生漂移，也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機(jī)溶劑混合時(shí)，混合液變化大，往往會(huì)與室溫相差很大，務(wù)必注意。
3.做HPLC流動(dòng)相的試劑應(yīng)用HPLC級(jí)的、水應(yīng)用二次蒸餾水，水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換，防止長(zhǎng)菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水（炊用）并不合適、尤其是做梯度洗脫時(shí)，水中的不純物會(huì)成為鬼峰，從而干擾分析結(jié)果。
4.流動(dòng)相的pH值過(guò)高或過(guò)低，流動(dòng)相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對(duì)試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞，這種對(duì)色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的。
5.用緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí)，在使用前和使用后都要用水清洗流路，絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
6.若需要使用含鹽的流動(dòng)相，使用前請(qǐng)務(wù)必過(guò)濾。并且使用該含鹽流動(dòng)相前，色譜柱需先用低比例有機(jī)相（有機(jī)相含量應(yīng)不低于10%）的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動(dòng)相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，以免流動(dòng)相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
7.進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意梯度變化過(guò)程中流動(dòng)相的互溶性，避免因流動(dòng)相不互溶而導(dǎo)致的緩沖鹽析出問(wèn)題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時(shí)，用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲(chǔ)存流動(dòng)相后在接柱子。
8.在更換兩種互不相溶的流動(dòng)相時(shí)，中間要用異丙醇溶液清洗過(guò)渡。例如：先用甲醇水做流動(dòng)相，然后在用正己烷做流動(dòng)相時(shí)，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動(dòng)相時(shí)還要考慮色譜柱是否更換。
9.儀器在短期（兩三天）不用時(shí)，流路中可以是甲醇或水。儀器在長(zhǎng)期不用時(shí)，流路中應(yīng)用甲醇。
10.對(duì)于UV等檢測(cè)器用于高靈敏度檢測(cè)時(shí)，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動(dòng)相溶劑，如甲醇、乙腈等。
11.當(dāng)流動(dòng)相溶劑為乙腈時(shí)，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大，導(dǎo)致泵的流速降低。可適當(dāng)提高流速使泵的壓力恢復(fù)正常即可。
12.流動(dòng)相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會(huì)對(duì)流路中的PEEK樹脂管路強(qiáng)度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動(dòng)相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對(duì)流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時(shí)，分析完了后，應(yīng)立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
13.用于檢定梯度等性能時(shí)，短時(shí)間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問(wèn)題的。
14.注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會(huì)引起爆炸。
06 液相色譜流動(dòng)相的貯存
流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過(guò)。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現(xiàn)象。
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