手機版
高效液相色譜法（HPLC）具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點，廣泛應用于醫藥、環保、石化、食品、化工等行業，是現在分離分析的重要方法，本文著重介紹HPLC的工作原理、基本組成及高效液相色譜名詞術語，使新學者快速了解高效液相色譜知識，在日常操作中理論與實踐結合，確保HPLC的高效運行、快速分析。
1
HPLC工作原理
100多年前俄國植物學家Tswett(茨維特) 他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下,結果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶，Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他的實驗方法，即現在的Chromatography(色譜法)。
Tswett(茨維特)色譜實驗
色譜法是通過是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學作用性能的差異，當兩相作相對運動時，使各組分在兩相中反復多次受到上述各作用力而達到相互分離，色譜法的本質是分離分析方法。
色譜分離原理
兩相中的一相是固定的，叫作固定相(Stationary Phase)，一相是流動的，叫作流動相(Mobile Phase)，又叫洗脫劑。用液體作為流動相的，即為液相色譜(Liquid Chromatography, LC)。
HPLC為High Performance Liquid Chromatography的縮寫（High高、Performance性能、Liquid液體的、Performance 色譜），是一種區別于經典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段，具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點。
2
HPLC分類
按固定相和流動相的相對極性分為正相色譜(NormalPhaseChromatography)和反相色譜(Reversed Phase Chromatography)。
正相色譜：固定相的極性大于流動相。
反相色譜：固定相的極性小于流動相。
有機化合物極性是指分子間作用力(靜電引力、偶極力、色散力、氫鍵力)綜合表現的一種表述。
正相色譜法與反相色譜法比較表
|
正相色譜法
|
反相色譜法
|
|
|
固定相極性
|
高～中
|
中～低
|
|
流動相極性
|
低～中
|
中～高
|
|
組分洗脫次序
|
極性小先洗出
|
極性大先洗出
|
從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
按分離過程的機理分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和體積排除色譜。
吸附色譜(Absorption Chromatography)：根據樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實現分離。
分配色譜(Partition Chromatography)：分離基于樣品組分在固定相和流動相中的溶解度(分配系數)不同。
離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)：根據樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡稱離子色譜(IC)。
體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography)：分為GPC和GFC。
GPC(Gel Permeation Chromatography凝膠滲透色譜又稱尺寸排阻色譜)：固定相是疏水性凝膠,流動相是水或緩沖溶液-有機溶劑。
GFC(Gel Filtration Chromatography凝膠過濾色譜又稱水系凝膠色譜)：固定相是親水性凝膠,流動相是水或緩沖溶液。
3
HPLC組成
HPLC由溶劑輸送系統（脫氣機、高壓泵等）、進樣系統（定量泵、六通閥、定量環、進樣針等）、分離系統（色譜柱等）、檢測系統（檢測器等）、記錄及數據處理系統。
高壓輸液泵：將流動相在高壓下連續不斷地送入液路系統，具有有足夠的壓力，輸出流量恒定、可調，輸出壓力平穩，泵室體積小，泵體抗腐蝕、耐酸等特點。
壓力平穩、流速恒定是HPLC系統穩定、重現性良好的前提條件，多數的HPLC故障、色譜數據異常均會表現出壓力異常，如偏高、偏低、波動大等，在日常使用中需要特別關注壓力變化。
在線脫氣機：四元低壓系統屬于泵前混合，由于在常壓下混合，極易產生氣泡，必須配有在線脫氣機，并要求流動相使用前進行脫氣，流動相脫氣得目的如下：
-
使色譜泵輸液均勻準確，減小脈動。
-
提高保留時間和色譜峰面積的重現性。
-
防止氣泡引起尖峰。
-
使基線穩定，提高信噪比。
-
降低溶劑的紫外吸收本底。
-
減少死體積。
-
防止填料氧化。
進樣系統：分為手動進樣系統和自動進樣系統， 主要由定量環、六通閥、進樣針等部件組成。手動進樣系統的定量環用于準確定量，分為5μl、10μl、20μl等，需要根據不同進樣量選擇合適的定量環；自動進樣系統儀器自帶定量環多為100μl，如進樣量大于定量環體積需咨詢相應儀器工程師更換定量環及計量泵等，六通閥是最理想的進樣部件，由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成，通過閥切換保證恒定的流速，下圖為六通閥不同狀態流路示意圖。
分析液相多數配自動進樣系統，自動進樣系統具有進樣精度高、重現性好、可用于大量樣品分析等特點。
分離系統：包括色譜注、柱溫箱，連接管線等部件。
色譜柱一般用內部拋光的不銹鋼制成。其內徑為2～6mm，柱長為10～50cm，柱形多為直形，內部充滿3～10 μm高效微粒固定相，根據不同的實驗需求需要選擇不同填料、不同規格的色譜柱。
柱溫箱：保證分離系統的溫度恒定，降低溫度波動對色譜基線、保留時間及色譜分離的影響，包括普通柱溫箱及帶有冷卻功能的柱溫箱，普通柱溫箱可以根據方法需求設定高于室溫的溫度（一般應高于室溫5℃以上），降低柱壓或是改善色譜分離，帶有冷卻功能的柱溫箱可以升高柱溫外,還可以設定低于室溫的溫度，預防穩定性差樣品的降解，各品牌柱溫箱的控溫范圍略有差別，需要通過相應產品說明書或咨詢客服了解。
需要特別注意的是有些品牌的柱溫箱是沒有配置預加熱模塊的，對于溫度敏感的樣品需要在柱前連接一段管線，對流動相進行預加熱，管線長度及內徑需適當，盡量降低死體積。
檢測器：包括紫外可見吸收檢測器(UVD)、熒光檢測器(FD)、蒸發光檢測器（ELSD）、示差折光檢測器(RID)、電化學檢測器(ED)、化學發光檢測器(CD)、質譜檢測器（MS）等類型，其技術要求為靈敏度高、噪音低、線形范圍寬、響應快。
紫外可見吸收檢測器(UVD)：波長范圍190～800mm，190～400mm為紫外區域，氘燈，400～800mm為可見光區域，鎢燈。其特點為靈敏度高，最小檢測濃度10-9g/ml，線性范圍寬，對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫，應用范圍廣。適用于帶有共軛基團的化合物，為最常用的檢測器。
熒光檢測器(FD)：氘燈作激發光源，波長范圍250～600nm。其特點為靈敏度更高，檢測限10-12～10-13g/ml（靈敏度比UV檢測器高2～3個數量級），選擇性好，對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫，所需試樣量少，適于痕量分析，應用于組分吸收一定波長紫外光后發射熒光的物質，且熒光強度與濃度成正比。
蒸發光檢測器（ELSD）：是一種通用型的檢測器，可檢測揮發性低于流動相的任何樣品，而不需要樣品含有發色基團。蒸發光散射檢測器靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基線穩定，適合與梯度洗脫液相色譜聯用。被廣泛應用于碳水化合物、類脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測。其主要缺點為響應值與濃度不呈線性，需取響應值的對數與濃度計算線性。
示差折光檢測器(RID)：是一種連續檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數差值的通用型檢測器，其優點為對糖類檢測靈敏度較高，其檢測限可達10-8g/ml；穩定性好，操作方便，缺點該檢測器對多數物質的靈敏度低（約10-5g/ml）,通常不用于痕量分析；受環境溫度、流動相組成等波動的影響較大，不適合梯度洗脫。
質譜檢測器（MS）:將樣品中的分析物電離，不同質量離子在電場或磁場中，將按其質量和所帶的電荷比（質荷比，m/z）進行的分離和排序，根據質荷比的大小和相對強度形成規則的質譜，從而對物質進行結構鑒別和定量分析。質譜分析具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時進行等優點，但流動相中不能含有無機鹽。
4
HPLC名詞術語
色譜圖(Chromatogram): 色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖,其縱坐標為信號強度,橫坐標為時間。
色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時產生的響應信號。
峰底(Peak Base):峰的起點與終點之間連接的直線。
峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距離。
峰面積(Peak Area):峰與峰底之間的面積,又稱響應值。
基線(Baseline):在正常操作條件下,僅由流動相所產生的響應信號。
基線飄移(Baseline Drift):基線隨時間定向的緩慢變化。
基線噪聲(N)N)(Baseline Noise):由各種因素所引起的基線波動。
譜帶擴展(Band Broadening):由于縱向擴散,傳質阻力等因素的影響，使組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現象。
保留時間(tR)(Retention time):組分從進樣到出現峰最大值所需的時間。
死時間(t0)(Dead time):不被固定相滯留的組分,從進樣到出現峰最大值所需的時間。
保留體積(VR)(Retention volume):組分從進樣到出現峰最大值所需的流動相體積。
死體積(V0)(Dead volume):不被固定相滯留的組分,從進樣到出現峰最大值所需的流動相體積。
等度：在整個運行過程中溶劑組成保持不變，如(60:40 甲醇/水)。
梯度：在運行過程中溶劑組成變化，漸變或臺階式變化，如100%的 H20/ 0%的MeOH到0%的H2O/100%的MeOH。
分離度：用于評價待測物質與被分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統分離效能的關鍵指標。除另有規定外，待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應大1.5 ,分離度的計算實例如下圖：
理論塔板數(N):分離效率的量度，用于評價色譜柱的分離效能。
拖尾因子：用于評價色譜峰的對稱性。
重復性：用于評價色譜系統連續進樣時響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%；采用內標法時，通常配制相當于80%、100和 120%的對照品溶液，加人規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其相對標準偏差應不大于2.0%。
5
HPLC日常操作注意事項
選擇流動相時應注意的幾個問題：
-
盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。
-
避免流動相與固定相發生作用而使柱效下降或損壞柱子。
-
試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積。
-
流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有較強的紫外吸收，一般檢測波長應大于流動相的截止波長。
泵的維護保養：
-
防止任何固體微粒進入泵體，否則會磨損柱塞、密封環缸體和單向閥，因此應預先對流動相進行過濾，可采用Millipore濾膜(0．22μm或 0．45μm )等過濾。泵的入口都應該連接砂濾棒(或片)， 輸液泵的濾器應經常更換。
-
流動相不應含有任何腐蝕性物質， 含有緩沖液的流動相不應保留在泵內， 尤其是停泵過夜或更長時間。分析工作結束后必須用純水充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合固定相，可以是甲醇或甲醇和水)
-
泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、密封環或缸體，最終產生漏液。
-
輸液泵的工作壓力不要超過規定的最高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。
紫外檢測器維護保養：
-
流通池進入氣泡會干擾基線，并極難排出，應使用充分脫氣的流動相，以減少氣泡的產生。
-
應定期沖洗系統，避免流通池干涸。
-
檢測器中氘燈( 光源) 隨著使用時間的增加，氘燈強度降低，噪音會不斷增大，故分析前柱平衡得差不多時，再打開檢測器，分析工作結束及時關閉檢測器（頻繁開關檢測器也會縮短檢測器壽命，一般開啟間隔少于4小時，不建議關閉檢測器）。
-
塵埃在靜電的作用下容易覆蓋在光學元件上， 使光傳播效率降低，增加了光散射， 影響分析效果， 因此檢測器周圍的環境應保持清潔。
參考文獻：
［1］中國藥典2015版四部通則0512高效液相色譜法
［2］趙貝貝，張艷，唐濤，等．高效液相色譜的使用與維護．實驗室科學，Jun. 2011，Vol. 14 No. 3
［3］王淑靜，畢建杰，柳洪潔，郝建民，等．高校液相色譜使用中常見問題及對策．實驗室研究與探索， 11. 2010 ，Vol. 29 No. 11
