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關于高效液相首選等度洗脫，流動相比例越簡單越好，能不用緩沖鹽就不用，洗脫方法越簡單越好、色譜柱越常見越好，但是有的時候用單一比例的流動相或者是常見色譜柱是無法滿足很多雜質的分離，這時就需重新開發色譜分離方式。下面為一些分析條件開發的個人的經驗，希望給新入行的朋友一些實驗靈感。
01
確定目標化合物性質
首先需要明白待分離雜質的一些性質，比如說分子量、結構式（主要看有哪種基團），以及該種物質在哪種有機溶劑中易容。結構式對于分子極性大小的預測以及判定該物質是否容易水解有非常重要的作用。例如我們常見的-、-NHR、-、-COOH、-0H等都是比較常見的極性基團；而常見的苯環、-CH=、--等都是常見的非極性基團。根據經驗可以大致的判斷一下物質的極性，預估一下在常用的色譜柱上是否保留，再結合雜質在各種常見洗脫溶劑中的溶解性，例如在甲醇、乙腈、正己烷中哪個比較易溶，選擇適合用于洗脫的有機流動相，從而確定方法開發時是用正相色譜柱或者是反向色譜柱做出粗略判斷。
02
確定正反相洗脫方式
確定洗脫方式后，反向的話個人推薦先用60%的乙腈或者是甲醇，先去看一下你需要分離的幾種物質能否被分開，（正相洗脫方式思路相近）。在能分開的前提下，再看一下最后一個峰的出峰時間，如果時間比較長的話，再根據前幾個峰的分離度確定是否需要加大或者縮小有機相的比例。我們常見的洗脫分離方式為反相分離，而反相洗脫方式又分為兩種體系，一種是甲醇-水體系，另外一種是乙腈-水體系。
具體是選擇哪種反相洗脫體系需要根據以下條件來決定：
A、乙腈的洗脫能力要優于甲醇，在同等濃度、樣品下乙腈-水體系的目標峰出峰要快于甲醇-水體系。
B、甲醇溶于水是會放出熱量的，乙腈溶于水是會吸熱的，在同等方式的梯度洗脫方式下，在兩種流動相互相混合時由于分子熱運動的原因，甲醇溶于水比乙腈溶于水時的分子熱運動劇烈，這樣兩種流動相的混合會更加均勻，反映在基線上的表現為基線更加的平滑，且梯度峰要更少。
C、甲醇在市面上的售價要低于乙腈（如果財大氣粗的公司可以忽略這一條）。
D、甲醇的分子量大于乙腈，在同一色譜柱、相同濃度的有機相濃度下，乙腈-水體系的柱壓更小。
E、甲醇的截止吸收波長在210nm附近，而乙腈的截止吸收波長在190nm附近，在檢測波長遠離210nm的時候選擇甲醇或是乙腈-水體系主要看其它影響因素。但是測定波長在210nm附近時，由于甲醇的截止吸收波長大于乙腈，除了流動相不同外，相同的測定條件下，乙腈-水體系測定的樣品響應值更高，從而能夠得到更小樣品檢出限，此時建議優選乙腈-水體系。
03
確定色譜柱、流速、柱溫
實驗室分析中最常用的就是類型的色譜柱，一般為5μm0.46×250mm或者是0.46×150mm，在試驗前期如果在沒有參考資料的情況下，首選最為普通的 5μm0.46×250mm的色譜柱試一下；如果發現用5μm0.46×250mm的色譜柱去分離多種雜質時，有分叉峰出現或是理論塔板數比較低時則提示我們這種類型的色譜柱對該物質的分離是不太好的，需要我們更換柱效更高的色譜柱，通常選擇粒徑、填料更小的色譜柱，這個需要根據實際情況，進行試驗后確定適用于檢測的色譜柱。
而流速的選擇通常是要根據色譜柱的具體類型，最高的耐受壓力來決定，常用的色譜柱一般流速為1.0mL/min，其實流量對雜質分離的影響比較小。
柱溫首選室溫，柱溫的升高會影響雜質的出峰快慢，理論上柱溫越高，各種物質的出峰會越快，同時色譜柱的柱壓也會越小，但是由于溫度比較高會導致色譜柱中填料的健合相容易被流動相沖刷下來，導致色譜柱不可逆的柱效下降。因此色譜柱溫度不宜過高，一般溫度設定為25~35℃，當然也有特殊的品種有的需要柱溫在40℃甚至更高。
04
梯度洗脫程序的篩選
在選擇好用正反相洗脫方式、確定用的色譜柱、柱溫、流速后，無論如何調整梯度及流動相比例都無法將兩種雜質分離開后，那么就需要用到梯度洗脫方式。梯度洗脫是一種在不同的時間加入不同有機比例流動相的一種洗脫方式。與傳統的等度相洗脫方式比具有以下優點：
A、能夠增加兩種物質的分離度，通過不同時間段加入有機相濃度的不同，使雜質在不同時間段受到有機相洗脫的濃度不同，一般原則是逐步增加有機相的比例，從而使難被洗脫出來的雜質加快出峰。
B、由于可以調整有機相加入的濃度，與等度洗脫相比，可以縮短分析時間，還可以一次性將等度洗脫分不開的幾種物質分開，從而用一種分析方法分析多種物質，降低成本。
梯度洗脫程序的摸索過程，需要遵循以下原則：
原則一：不使用單一流動相
初級實驗者梯度洗脫的時候，流動相A一般為緩沖鹽，流動相B一般為純的有機相。但是高級實驗者使用的A相往往不單純使用緩沖鹽，而是要加入一定比例的有機相，原因有兩個。
第一是加入最少5%的甲醇或者乙腈可以防止流動相長菌，減少頻繁的過濾流動相這一操作。
第二是加入一定比例的有機相可以減小在儀器進行流動相A、B相互混合時造成的基線波動，使基線更加平滑。至于流動相B到底是否是選擇純的有機相還是選擇一定比例的有機相例如（80%、90%的甲醇或乙腈）要根據實驗去做選擇。
本人推薦用一定比例的有機相為流動相B。因為在加入純的乙腈或者甲醇等有機相時，由于兩相在混合時會有吸熱或放熱的反應，會有很大的基線波動，用一定比例的有機相作為B相可以有效地減小流動相沖擊效應。
原則二：有機相加入梯度梯度盡量緩
以下為筆者自己的一個實驗項目，在進行梯度方法摸索時的一個案例，
梯度方法25洗脫程序
梯度方法26洗脫程序
梯度方法27洗脫方式
梯度方法27洗脫方式
梯度洗脫程序的比較可以看出，緩慢的加入有機相可以使梯度峰更加平滑，使各雜質峰的分離度更好。
關于梯度鬼峰的出現，如果純的緩沖鹽相與有機溶劑相相互混合時，會有很大的互溶沖擊效應的出現，這時候即使安裝市面上的比較常用的鬼峰捕集小柱，基線依然不是很平滑；所以我推薦用混合一定比例的有機相與鹽相的溶液作為混合鹽相，將混有一定比例水的有機相的混合液作為梯度洗脫的有機相，配合鬼峰捕集小柱的使用可以使基線更加平滑。
05
緩沖鹽的選擇
首先要明白為什么要加入緩沖鹽，緩沖鹽的作用之一是為了增加流動相的緩沖能力。一般常見的無機緩沖鹽（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫氨、乙酸銨等）的作用是為了調整流動相的緩沖能力；
何為緩沖能力？緩沖能力是指在其他溶液或者物質加入到流動相后，流動相pH變化程度的大小，流動相的pH變化越小證明流動相的緩沖能力越強，反之越弱。在一些標準上可以看到同一流動相的配置過程中需要使用的緩沖鹽有兩種，這是因為使用復合鹽作為流動相比使用單一的鹽作為流動相的緩沖能力強。有些待測主成分在中性或者堿性的環境中容易水解，例如帶-OH的基團，容易在中性、堿性環境中水解，在圖譜上表現為雙頭峰。為防止這種類型的水解，可以加入磷酸鹽用磷酸調節pH至酸性環境，從而抑制水解。
加入緩沖鹽的另外作用是為了增加待測成分的保留時間，通常帶有氨基的物質或者氨根的物質如-、-NHR、-等基團時，為了增加該物質的保留，可以添加-（硫酸基）的離子對試劑如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉，以增強保留。
一般來說緩沖鹽是不會出峰的，我曾經用pH調為3.0的水為流動相與用磷酸二氫鉀為緩沖鹽pH調為3.0的水溶液作為流動相，兩者圖譜出來的梯度峰吻合度非常好，所以各位同仁不必擔心緩沖鹽會造成梯度峰。造成梯度峰的直接原因是流動相混合沖擊。
06
檢測波長的選擇
關于檢測波長的選擇，需要結合多個雜質的紫外吸收圖譜去綜合考量，最好選擇紫外吸收特征圖譜上波峰處的波長作為檢測波長，但是也要兼顧其它雜質在該波長下是否有紫外吸收。
3個雜質的最大吸收分別為203.3、204.5、204.5nm，同時在205~230nm這個范圍內也可以作為次選波長。所以綜合考慮該三個雜質的檢測波長可以暫定為205nm。
波長選擇需要注意的點：190~210nm這個范圍內的波長慎重選擇，該波段的波長屬于低波段，受到的干擾比較多，尤其是受流動相中試劑的純度影響較大。如果遇到試劑不純或者水質不好時，就會有一個類似梯度峰的“峰”出現，此類峰往往比較平滑，并不像真正雜質的峰那樣尖銳，同時表現為無論如何調整梯度洗脫程序，始終在特定的位置“出峰”。如果該“峰”恰巧影響雜質出峰，那么消除起來就非常難了。
筆者曾經遇到的一個項目就被這種峰糾纏了好久，后來通過更換更高級別的試劑、更純凈的水、多次沖洗儀器、色譜柱，逐步排除后才解決問題，我曾試驗過，用DAD檢測器選用265nm、225nm、205nm分別作為檢測波長，該“峰”在265nm、225nm不會出現，所以205這個波長慎重選擇。
07
溶劑的選擇
如果用等度洗脫，首選用流動相作為溶劑，一般直接用流動相為稀釋劑已經足夠滿足日常分析要求。但對于梯度洗脫方式，最好選擇與初始梯度濃度相近溶液作為溶劑；但是不管是等度還是梯度洗脫，都要需要考慮以下幾點：
第一是溶劑對樣品的溶解能力，如果所選的溶劑對樣品的溶解能力不足，輕則不出峰，重則堵儀器、色譜柱。
第二是需要考慮溶劑出峰是否會對目標峰的分離造成影響，如果溶劑峰影響目標峰出峰，那么所選的溶劑肯定是不合適的。對于梯度洗脫溶劑的選擇，可以通過逐步調節溶劑中有機相與鹽相的比例，觀察圖譜來選擇合適的溶劑，同時要注意溶劑的pH、緩沖能力要盡可能的與流動相相當。
我們一直說的溶劑峰到底是個什么鬼？很多同仁做了很多年實驗也沒有真正的搞清楚，溶劑峰是由于溶劑中有機相與初始流動相中有機相的不同，二者在進樣后由于其極性不一樣，在同一波長下吸光度不一樣而導致的“出峰”，一般通過改變測定波長可以掩蔽溶劑峰的出現與否。
當然在實際的分析方法開發中，很多人覺得溶劑的選擇不是那么重要，往往忽視溶劑的重要性。下面是我做的一個項目中，由于溶劑選擇不當，引發的一個慘案。
不同的比例的流動相A與B混合出來的溶劑梯度峰是有差別的，在前期試驗時，要盡可能多試幾種不同濃度或種類溶劑，綜合去考慮應該考慮哪種溶劑作為最終的溶劑。
