色譜分析過程中，緩沖液是不可或缺的，因為要用它來調(diào)節(jié)流動相的pH值，緩沖鹽使用不當(dāng)，那柱子根本扛不住。

比如說，色譜柱壓升高、柱效下降、保留時間異常等不良影響，今天小編與大家一一分享。

1）柱壓升高；

原因：緩沖鹽使用不當(dāng)導(dǎo)致緩沖鹽析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙，阻礙流動相傳質(zhì)，引起柱壓升高。

2）相同化合物的保留時間發(fā)生變化；

原因：如果沒有沖洗干凈就進(jìn)行進(jìn)樣，色譜柱內(nèi)含有的鹽會使化合物的保留時間發(fā)生變化。

3）柱效下降；

原因：

i）有些緩沖鹽會滲入到鍵合相的深處，損害硅膠基體，導(dǎo)致色譜柱鍵合相流失，柱床變松，柱效下降；

ii）凝結(jié)在鍵合相表面，使C18碳鏈難以舒展，對物質(zhì)的保留能力下降，導(dǎo)致柱效下降。因此用過緩沖鹽后需要對色譜柱進(jìn)行沖洗，水中緩沖鹽濃度較大時應(yīng)特別引起注意。  

使用前和使用后的處理都是有講究的！

1. 使用前的處理: 在使用緩沖鹽作流動相之前需要用不含緩沖鹽的流動相沖洗色譜柱，直至基線平穩(wěn)。 原則上，用于沖洗的流動相與分析時所用的流動相含水的比例相同（或含水更多），不同的只是用于沖洗用的流動相中不含緩沖鹽。

理由：緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。用含緩沖鹽的（特別是做流動相的水為飽和的緩沖鹽溶液時）流動相進(jìn)行分析時，如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動相中含水的比例相對較小，不先沖洗掉，接下來做樣品的時候所用的流動相中如果有機(jī)溶劑含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時，緩沖鹽將會在色譜柱柱體上析出，沉積下來，這將可能導(dǎo)致上述對色譜柱的損害。

2. 使用后的處理：用與分析時含水比例相同的流動相（與分析用流動相唯一的區(qū)別是，用于沖洗的流動 相不含緩沖鹽）進(jìn)行沖洗約30min，直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來很長的一段時間內(nèi)不使用，要長期保存，則需再加上一步，即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍，直至基線平穩(wěn)。 

用與分析時含水比例相同的流動相（與分析用流動相唯一的區(qū)別是，用于沖洗的流動相不含緩沖鹽）進(jìn)行沖洗約30min，直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來很長的一段時間內(nèi)不使用，要長期保存，則需再加上一步，即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍，直至基線平穩(wěn)。緩沖液可以提供離子平衡的反離子，并使流動相保持一定的離子強(qiáng)度和ph值，減少拖尾。

注意事項，是關(guān)注的重點(diǎn)！

1、避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對鋼質(zhì)有腐蝕作用。

2、緩沖液最好要現(xiàn)配現(xiàn)用，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔天或放置長時間實驗時會有很多怪現(xiàn)象發(fā)生。

3、實驗后不可用有機(jī)溶劑直接過度，有機(jī)溶劑會處使鹽類析出，造成液路或色譜柱堵塞，可用95：5的水甲醇沖洗。

4、使用緩沖液要及時掌握pH范圍，做到胸中有數(shù)。

5、清洗液路和柱子時，有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗。

6、長時間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類析出，可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路（拆下柱子，走30ml,再用5倍水沖洗）可以避免液路的堵塞。

7、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩。

如果流動相中有機(jī)溶劑的比例很高是不能用來沖洗緩沖鹽的，是洗不出來的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗，是可以把緩沖鹽沖洗出來的，然后用純的有機(jī)溶劑來保護(hù)柱子。

最好的方法是使用與流動相相同濃度不含鹽的流動相進(jìn)行清洗，但就是速度慢一些。用水是為了快速替換，一般在15分鐘以內(nèi)最好，且用0.8的流速較好。如果用純水沖，容易造成鍵合的碳鏈的流失，最好用5%~10%甲醇水溶液沖。可以用純水代替流動相中的緩沖液，有機(jī)相不變。這樣沖洗柱子比較穩(wěn)妥。 

小結(jié)