如果色譜圖上出現的是雙峰：

（1）首先就會推測樣品可能含有兩個或以上的化合物。

（2）如果確保進樣的是化學純的單一物質，應當考慮是否是光學純的問題，即可能存在手性異構體，這就需采用手性色譜柱進行分析；此外，還需考慮是不是樣品不穩定的原因，在該分析條件下迅速降解成兩個或以上的化合物。前面兩種情況很好解決，畢竟是兩個不同的化合物，更換色譜柱、調整分析條件就能將其分開。

（3）如果確保進樣的是光學純的單一物質，且該結構在此色譜條件中穩定，仍然出現了雙峰，通常被稱為色譜雙峰，也就是單一物質在色譜圖中出現雙峰的現象。這種情況非常容易誤導分析者的判斷，那么色譜雙峰該如何判別區分？是什么原因產生，又該如何解決呢？可以從以下幾方面思考色譜雙峰的產生的原因。

色譜柱或保護柱污染或塌陷
01

這是遇到色譜雙峰首先考慮的方面，如果你分析樣品時發現每個色譜峰都出現雙峰（出峰越快，出現雙峰的可能性越少），尤其采用單一純物質時，可以判定色譜柱出問題（柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失）。如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭端堵塞，將色譜柱反接沖洗維護，一般情況下可以解決。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭填料受污染或鍵合相流失可能性更大，這時可以對色譜柱維修處理或者使用新的色譜柱，維修建議交由廠家處理。

解決方案：將保護柱拿掉，檢測色譜雙峰是否有改善。如果沒有使用保護柱，那就是色譜柱污染或者堵塞（可以通過壓力判斷），最好的方法是將色譜柱反過來接，用流動相或其它溶劑沖洗、酸洗，將堵在柱頭的殘留物沖掉，一般情況下可以解決色譜雙峰問題。如果依舊不行，那就是強吸附物質污染了色譜柱，則有必要采取色譜柱再生的方法。

溶劑效應
02

這是雙峰產生的一個很重要的原因，即樣品溶劑與流動相的相容性不好，導致單一物質出現色譜雙峰。例如當以中等極性的溶劑作為進樣溶劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而流動相體系中以強極性水為主，樣品進樣體積較大時，很可能出現色譜雙峰現象。主要是由于樣品溶劑與流動相極性相差太大，流動相來不及將進樣溶劑稀釋，從而引起色譜柱內的環境突然發生較大的變化（即極性不均勻），造成組分洗脫不均勻，導致色譜峰裂分或分叉。對極性比較敏感的化合物容易產生此種情況，通常表現在出峰時間較早的色譜峰裂分，對較晚的色譜峰影響較小，且第二峰比第一峰小，常伴有拖尾。

解決方案：調整樣品的進樣溶劑，盡可能與流動相溶劑保持一致；此外，減小樣品的進樣體積，亦可以減少色譜雙峰的發生。

進樣量過載
03

通常表現為雙峰緊靠在一起，基本上齊高不拖尾。主要是由于樣品進樣濃度很高或進樣體積很大，色譜柱過載，從而出現色譜雙峰。如果降低進樣量將樣品稀釋后再進樣，色譜雙峰基本就可以改善。

解決方案：將樣品稀釋，同時減少進樣體積。

流動相的酸堿度
04

這種情況主要針對弱酸堿性化合物而言。流動相中酸堿pH值不僅與峰拖尾相關，同時也可能出現色譜雙峰。通常是第二峰比第一峰小，當出峰時間較早時，兩峰高差距較大，第二峰較小，甚至消失；當出峰時間較長時，峰高趨于相等。主要可能是樣品在流動相中存在酸堿解離平衡，化合物同時存在已解離和未解離兩種分子狀態。我們曾采用HPLC制備分離過一類膽汁酸類成分，流動相中加入0.01%甲酸，雖色譜峰不拖尾，但幾乎每個膽汁酸類色譜峰裂分成雙峰。當提高流動相中甲酸的濃度至0.05%和0.1%，可以明顯看到膽汁酸色譜峰的裂分距離縮小，明顯的由色譜雙峰向單峰融合。

解決方案：改變流動相中酸堿的pH值，提高酸堿的濃度，在更強的酸堿性條件進行分析。

樣品的互變異構
05

如果某一物質出現雙峰，兩峰緊靠且不拖尾，條件稍加變化，如pH、溫度改變，雙峰消失或減小，例如紅霉素等。有的樣品采用LC/MS分析時，紫外色譜圖雖不易觀察到雙峰，但質譜總離子流圖出現較為明顯的色譜雙峰。這可能與特定的物質有關，由于其化學結構的特點，存在互變異構現象，這種互變異構體無法分開，而是以一個動態平衡存在，如酮式和烯醇式互變。

解決方案：了解樣品性質，調整色譜方法，如改變流動相或進樣溶劑中pH值、緩沖鹽，降低或升高柱溫箱的溫度等，以減少互變異構的發生，促使樣品在分析條件中主要以單一構型為主。

儀器參數設置不合理
06

參比波長設置錯誤，例如設置分析波長254nm，參比波長400nm，這個對于大多數化合物可能沒影響。但是如果被測化合物，在400nm處也有強的紫外吸收，比254nm更強。這樣其出峰時，由于背景的抵扣作用，本來一個峰會變成對稱的二個峰，而且如果將二峰之間的峰谷反轉180度，恰好是一個完整的峰。這時要將參比波長設置更大，或者取消。