一、用途

HKM^®鏈球菌乳膠試劑盒用于對選擇性平板上分離出的可疑鏈球菌以Lancefield方法進行A、B、C、D、F和G分群。

從感染鏈球菌病人分離出的大部分鏈球菌具有特異性血清群抗原。鑒定這些菌株包括從培養(yǎng)物中提取和鑒定這些特異性抗原。鏈球菌分群系統(tǒng)試劑盒內有可快速提取碳水化合物抗原的酶試劑和可快速鑒定提取出的A、B、C、D、F和G特異抗原的系列乳膠試劑。

該試劑盒僅供專業(yè)人員使用。

二、原理

試劑盒內乳膠試劑顆粒表面包被與鏈球菌A、B、C、D、F或G群碳水化合物抗原分別具有特異性的兔抗體。

從平板上分離的可疑鏈球菌菌落經(jīng)酶試劑培養(yǎng)以提取抗原，提取出的抗原在檢測板用6種分別含有一種A、B、C、D、F或G特異性抗體的乳膠試劑懸液測試，如果存在某抗原，其對應的乳膠顆粒會凝集，而其它乳膠試劑則保持光滑狀態(tài)。

三、試劑盒組成成分

每個試劑盒內含50次測試的試劑，試劑瓶標簽上標有每種試劑的失效期。

HM47a REAG A   試劑A　　2.5mL

含有包被鏈球菌A群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47b REAG B 　試劑B　 2.5mL

含有包被鏈球菌B群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47c REAG C　 試劑C　 2.5mL

含有包被鏈球菌C群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47d REAG D　 試劑D　 2.5mL

含有包被鏈球菌D群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47f REAG F　 試劑F　 2.5mL

含有包被鏈球菌F群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47g REAGG　 試劑G　 2.5mL

含有包被鏈球菌G群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

　HM47ｐCONTROL + 　陽性對照試劑　1.0mL

含有無活性的鏈球菌A、B、C、D、F和G多價抗原提取物和0.099%的疊氮化鈉防腐劑。

HM47x  ENZ 　　酶試劑　2×10mL

凍干的酶提取試劑

使用說明書

檢測板

攪拌棒

需要的其它材料

l         接種環(huán)

l         塑料或玻璃試管

l         可分裝0.4mL容積的移液器

l         37℃水浴鍋

l         樣品滴管或移液管

l         實驗室計時器

四、警告和注意事項

1、試劑僅供體外診斷使用。

2、不要使用過期產(chǎn)品。

3、不要造成試劑或樣品的交叉污染。

4、按說明書使用試劑盒。

5、不要用嘴吸取試劑或樣品。

6、所有臨床樣品及其培養(yǎng)物均應遵循按潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序。被污染的物品可用3%的次氯酸鈉消毒處理30分鐘。含酸的廢液應作中和處理。

7、試劑盒內作防腐劑使用的0.099%疊氮化鈉應小心處理，疊氮化鈉可與鉛或銅制品反應形成易爆的金屬疊氮化物。可用大量水沖洗以避免疊氮化物的堆積。

五、貯存

檢測試劑盒不使用時應貯存在2～8℃，不要凍存。在這種條件下，可保證包裝盒內的產(chǎn)品在有效期內的有效性。

試劑盒內酶提取試劑在加水溶解后，2～8℃保存時，可使用3個月。如需延長保存期，可在溶解后每支試管分裝0.4mL，在－20℃或更低的溫度下凍存可使用6個月。酶試劑不可重復解凍和凍存。

顯示變質的跡象

出現(xiàn)下列情況時，產(chǎn)品可能失效：

l         乳膠試劑出現(xiàn)明顯結塊，并且強烈搖動幾秒鐘后無法消除。

l         陽性對照試劑或酶試劑出現(xiàn)絮狀或沉淀

l         在規(guī)定時間內，陽性對照試劑與1個或幾個乳膠試劑反應不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

l         未接種的酶試劑與乳膠試劑出現(xiàn)凝集反應。

不要使用發(fā)生變質跡象的產(chǎn)品。

六、樣品及其準備

試劑盒用于檢測在培養(yǎng)基上經(jīng)過夜培養(yǎng)的可疑鏈球菌菌落。對于樣品收集及處理、接種及培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可參考相關資料。檢測的可疑菌落可選取平板上初步分離的培養(yǎng)物或再次轉接的新鮮純培養(yǎng)物。不可直接檢測保存的菌株。溶血特性是鑒定分析中的一個重要特征，是否作溶血性鑒定分析取決于檢測的可疑菌落是否來自血基礎培養(yǎng)。

七、檢測過程

質量控制：

應定期作陽性對照測試，以確證檢測試劑的有效性。

在測試過程中，應準備好陽性對照試劑，并代替用酶試劑制成的菌懸液進行測試。陽性對照試劑應與所有的乳膠試劑形成凝集反應。如果未出現(xiàn)凝集表明試劑失效。

如果需要作陰性對照檢測，可用不加培養(yǎng)物的酶試劑代替用酶試劑制成的菌懸液進行測試。

測試程序：

1、所有試劑在使用前應達到室溫。

2、在使用前，加10mL蒸餾水溶解酶試劑。輕輕搖動，以溶解均勻。每個試管中分裝0.4mL酶提取液。

3、用接種環(huán)從平板中挑取可疑的鏈球菌菌落加入酶溶液中，制成菌懸液。為保證檢測結果，至少應取4－5個常規(guī)大小的菌落或相當?shù)慕臃N量。酶溶液中接種量過多時，可引起非特異性凝集（如13.1.3）。如果菌落微小，應洗脫大量菌落。

4、將試管置37℃水浴鍋中恒溫10～15分鐘。恒溫5分鐘時，應搖動試管。在檢測前應充分振搖試管，以獲得均勻的抗原懸液。

5、在使用前，搖動乳膠試劑以形成均勻的懸浮液。然后將各種已搖勻的乳膠試劑分別各滴1滴在6個不同的反應環(huán)內。

6、分別在6個已滴加乳膠試劑的反應環(huán)內滴加1滴酶提取液（或陽性對照試劑，見“對照”部分）

7、分別用不同的攪拌棒混勻反應環(huán)內的2滴試劑，并在整個反應環(huán)內涂布均勻。不要用同1支攪拌棒混勻不同反應環(huán)內的溶液。

8、輕輕搖動檢測板1分鐘上，以充分混合環(huán)內的溶液。

9、觀察并記錄凝集結果，如果存在鏈球菌，應會形成肉眼可見的明顯凝集。

八、結果判斷

在1分鐘的反應時間內，如果形成肉眼可見的凝集，表明菌懸液是陽性。如果提取物中抗原濃度較高，可快速形成大塊凝集顆粒，如果菌懸液提取物中抗原濃度較低，凝集所需時間較長，凝集的顆粒會較小。但陽性和陰性反應結果區(qū)別依然較明顯。

如果乳膠試劑保持原來的光滑乳狀，無明顯凝集，說明菌懸液是陰性。如果有不明顯的微弱凝集，應忽略，判斷為陰性。

預期結果

β－溶血的菌落：

1、單個乳膠試劑凝集表明該菌株鑒定為相應的血清群。

以下情況應考慮增加其它的驗證試驗：

l         對于D群菌株，應做生化鑒定分析以區(qū)分D群鏈球菌菌株與D群腸球菌（其對抗生素有較高的抗性）。

l         對于菌落微小的A、C或G群菌株，應做生化鑒定以證實為S.milleri或咽峽炎鏈球菌。

2、多個乳膠試劑凝集，表明不同群的多個菌落混合生長，或單一菌株有多個群的抗原（如D群鏈球菌同時含有G群抗原）。可以進一步考慮下列實驗：

l         進一步分離培養(yǎng)以獲得純菌落重新進行測試。

l         同時含有D群和G群抗原的菌株應進一步做生化鑒定以區(qū)分腸球菌與D群鏈球菌菌株（含兩種抗原的腸球菌可能比只含有D抗原的菌株對抗生素抗性更強）。

3、所有乳膠試劑均凝集，可能是加入酶溶液中的接種物過多，或測試的培養(yǎng)物有污染菌株引起非特異性凝集，（一般情況下，可以通過識別菌落特征以確認）。可以進一步考慮下列實驗：

l         使剩余的酶提取物沸騰2～3分鐘上，冷卻后進行重新測試，可能得到清晰的結果。

l         減少酶溶液中的接種物，重新測試。

l         進一步分離培養(yǎng)，獲得純菌落重新進行測試。

4、乳膠試劑均無明顯凝集，測試樣品中可能無A、B、C、D、F或G群鏈球菌存在，或存在的數(shù)量低于檢測限。可以進一步考慮下列實驗：

l         使用較多接種物重新進行測試，特別在懷疑是鏈球菌D群或F群的情況時。

l         未得到分群結果的β－溶血鏈球菌，必要時用生化實驗進行鑒定分析。

非β－溶血的菌落：

如果出現(xiàn)單一的乳膠凝集結果顯示為B群或D群，可較好的表明菌株所鑒定的結果。如果結果顯示為A、C、F或G群，則不能說明菌株為所鑒定的結果，應采用其它鑒定方法。

可以考慮增加以下程序：

l      如果結果顯示為D群，應做進一步的生化鑒定以區(qū)分腸球菌與D群鏈球菌。

其它相關結果應參考以上信息進行判斷。

九、使用的局限性

結果應依據(jù)所有的臨床或實驗室信息進行判斷。精確的結果依賴于適當?shù)木�株濃度。偶爾可能會存在下列情況：部分D群菌株的特征性抗原含量低或較微量。某些F群菌株較難從平板表面挑起，瓊脂培養(yǎng)基上添加0.51%～1%的葡萄糖可促進D群抗原的產(chǎn)生。添加葡萄糖會影響溶血現(xiàn)象的觀察。但當血清群的鑒定非常重要時值得考慮添加葡萄糖。

菌落較小的菌株培養(yǎng)時增加二氧化碳的含量可促進生長。

鏈球菌Q、R和S群可能也含有可檢測水平的D群抗原。

據(jù)報道，某些不相關的屬種含有類似于鏈球菌各群的抗原。例如埃希氏菌、克雷伯氏菌和假單胞菌可引起假陽性結果。通常情況下，這些菌株可從菌落形態(tài)上加以區(qū)別，不會造成鑒定時的混淆。

十、檢測效果對比

HKM^®鏈球菌乳膠試劑盒與一種已廣泛使用的商業(yè)化的乳膠試劑盒檢測效果對比，用二種產(chǎn)品檢測各獨立地點的臨床樣品。綜合結果如表1。

靈敏度　607/662＝92%

特異性　24/24＝100%

十一、重復性

批內重復性：通過以系列稀釋度的參照抗原和試劑盒對照抗原對同1批產(chǎn)品的靈敏度進行檢測。由不同的操作者隨機測試3次，最終效價由參考/對照抗原測定，并且3次定性分析結果完全一致。