無菌室的要求：

1、需要建立無菌室管理制度。

2、保持良好的衛生：相對濕度40%---60%，溫度20—22 ℃，最好安裝空調。

3、無菌室不得進行其他工作，非操作所使用的物件一律不得放入，檢后的余樣不得存放。

4、紫外燈的使用期限一般為300小時，要記錄使用時間，到期更換。

無菌操作及要求

以菌落總數、大腸菌群為例演示無菌實驗流程

對實驗臺、手、檢驗用具進行消毒（保證無菌環境和無菌實驗用品），微生物的理想環境是無菌，但是更應該做好防護，保護自己。防護衣服，口罩手套必須佩帶。

對實驗的臺面進行擦拭消毒，一般用75%乙醇或新潔爾滅溶液。

為保持無菌的進行，對手心手腕這些容易殘留細菌的部位進行消毒處理。

實驗臺上面的藥品、盛裝樣品的盒子等實驗用工具要進行消毒處理。

實驗前對培養基的檢查、無菌條件下稱樣

1）實驗前檢查大腸菌群培養基的量、導氣管內是否有氣泡。

2）開啟超凈臺風機、在無菌、空氣緩慢流動狀態下工作。

3）進行無菌稱樣，這一步其實最好是要佩帶手套的。

4）接種針滅菌

5）接菌試管口滅菌

6）取菌

在接種或向培養皿內倒培養基時，試管口或瓶壁外面不要接觸皿底，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。

總結

微生物實驗室工作人員，必須有嚴格的無菌觀念，許多實驗要求在無菌的條件下進行，主要原因：

一是防止試驗操作中人為污染樣品；

二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。

要求如下：

無菌室使用與管理要求

1．工作室應矮小、平整，面積小，高2.2-2.3米，內部裝修應平整、光滑，無凹凸不平或棱角等，四壁及屋頂應用不透水之材質，便于擦洗及殺菌。

2．室內采光面積大，從室外應能看到室內情況。

3．為保證無菌室的潔凈，無菌室周圍需設緩沖走廊，走廊旁再設緩沖間，其面積可小于無菌室。

4．無菌室、緩沖走廊及緩沖間均設有日光燈及供消毒空氣用紫外燈，殺菌紫外燈離工作臺以1米為宜 ，其電源開關均應設在室外。

5．無菌室與緩沖間進出口應設拉門，門與窗平齊，門縫要封緊，兩門應錯開，以免空氣對流造成污染。

6．無菌室的使用與管理

（1） 無菌室應保持清潔整齊，室內僅存放必須的檢驗用具如酒精燈、酒精棉、火柴、鑷子、接種針、接種環等。不要放與檢測無關的物品

（2） 室內檢驗用具及凳桌等保持固定位置，不隨便移動。

（3） 每2-3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作臺、門、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液噴霧消毒空氣，最后紫外燈殺菌半小時。

（4） 定期檢查室內空氣無菌狀況，細菌數應控制在10個以下，發現不符合要求時，應立即徹底消毒滅菌。無菌室無菌程度的測定方法：取普通肉湯瓊脂平板、改良馬丁培養基平板各3個（平板直徑均9厘米），置無菌室各工作位置上，開蓋曝露半小時，然后倒置進行培養，測細菌總數應置37℃溫箱培養48小時；測霉菌數則應置27℃溫箱培養5天。細菌、霉菌總數均不得超過10個為合格 。

（5） 無菌室殺菌前，應將所有物品置于操作之部位（待檢物例外），然后打開紫外燈殺菌30分鐘，時間一到，關閉紫外燈待用。

（6） 進入無菌室前，必須于緩沖間更換消毒過的工作服、工作帽及工作鞋。

（7） 操作應嚴格按照無菌操作規定進行，操作中少說話，不喧嘩，以保持環境的無菌狀態。

器材及場所的滅菌消毒

微生物檢驗用器材及場所必須進行滅菌或消毒處理，不同的對象采用不同的處理方法。

1． 高壓蒸汽滅菌: 工作服、口罩、稀釋液等，置高壓殺菌鍋內，一般采用121℃滅菌半小時,當然不同的培養基有不同的要求,應分別處理。

2． 火焰滅菌： 接種針、接種環等可直接火焰滅菌。

3． 高溫干燥滅菌： 各種玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160℃滅菌2小時。

4． 一 般消毒: 無菌室內的凳、工作臺、試管架、天平、待檢物容器或包裝均無法進行滅菌，必須用其他方法進行消毒處理，采用2%石炭酸或來蘇兒水溶液擦拭消毒，工作人員的手也用此法進行消毒。

5． 空氣的消毒： 開啟紫外燈照射30-60分鐘 即可。

準備工作

1． 先進行無菌室空間的消毒，開啟紫外燈30-60分鐘。

2． 檢驗用的有關器材， 搬入無菌室前必須分別進會滅菌消毒。

3． 操作人員必須將手清洗消毒，穿戴好無菌工作衣、帽和鞋，才能進入無菌室。

4． 進入無菌室后再一次消毒手部，然后才進行檢驗操作。

操作過程注意事項

1． 動作要輕，不能太快，以免攪動空氣增加污染；玻璃器皿也應輕取輕放，以免破損污染環境。

2． 操作應在近火焰區進行。

3． 接種環、接種針等金屬器材使用前后均需灼燒，灼燒時先通過內焰，使殘物烘干后再灼燒滅菌。

4． 使用吸管時，切勿用嘴直接吸、吹吸管，而必須用洗耳球操作。

5． 觀察平板時不好 開蓋，如欲沾取菌落檢查時，必需靠近火焰區操作，平皿蓋也不能 大開，而是上下蓋適當開縫。

6． 進行可疑致病菌涂片染色時，應使用夾子夾持玻片，切勿用手 直接拿玻片，以免造成污染，用過的玻片也應置于消毒液中浸泡消毒，然后再洗滌。

7． 工作結束，收拾好工作臺上的樣品及器材，最后用消毒液擦拭工作臺。